УДК 616-089.873.4

 К.А.ВОРОБЬЁВ, С.А. БОЖКОВА, Л.И. АНИСИМОВА, Г.И. НЕТЫЛЬКО

Российский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии имени Р.Р. Вредена МЗ РФ, г. Санкт-Петербург

Контактная информация:

Воробьёв Константин Александрович – научный сотрудник хирургического отделения по координации донорства органов и/или тканей человека

Адрес: 195427, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Байкова, д. 8, e—mail: vorobyov_doc@mail.ru

Проведено исследование двух групп костнозамещающих материалов на основе губчатой кости, заготовленных разными способами. Эксперимент in vivo выполнен на 24 кроликах породы Шиншилла со сформированным полостным дефектом, замещенным исследуемыми материалами, по 12 животных в группе: экспериментальная группа (n=12) и контрольная группа (n=12). Гистоморфологические исследования выполняли в обеих группах на 7, 21, 45 и 90 сутки наблюдения, окраску препаратов проводили гематоксилином и эозином, методом Маллори. Выявлено, что методы обработки и стерилизации, применяемые в ходе изготовления костнозамещающего материала, изменяют его остеокондуктивные и остеоиндуктивные характеристики, влияют на процессы резорбции, остеоинтеграции и ремоделирования после имплантации при реконструктивно-пластических вмешательствах на костных тканях скелета.

Ключевые слова: костный дефект, костнозамещающие материалы, остеоиндукция, остеокондукция, остеоинтеграция, ремоделирование.

 

K.A. VOROBYOV, S.A. BOZHKOVA, L.I. ANISIMOVA, G.I. NETYLKO

Russian Scientific Research Institute of Traumatology and Orthopedics named after R.R. Vreden of the Ministry of Health of the Russian Federation, Saint Petersburg

 Effect of the osteoplastic material processing methods on the remodeling in the experimental bone defect model in vivo

 Сontact details:

Vorobyov K.A. – Researcher at the Surgical Department for Coordination of Donation of Human Organs and/or Tissues

Address: 8 Akademika Baykova St., Saint Petersburg, Russian Federation 195427, Russian Federation, e-mail: vorobyov_doc@mail.ru

Two groups of bone-replacement materials based on the cancellous bone and processed by two different methods were studied. The in vivo experiment was performed on 24 rabbits of the Chinchilla breed with a formed cavity defect, replaced by the test materials, 12 animals per group: the experimental group (n=12) and the control group (n=12). Histomorphological studies were performed in both groups at the 7, 21, 45, and 90^th days of observation, staining was performed with hematoxylin and eosin, and Mallory method. It is revealed that the methods of processing and sterilization used in the manufacture of bone-substituting material, change its osteoconductive and osteoinductive characteristics, affect the processes of resorption, osteointegration and remodeling after implantation during reconstructive plastic interventions on the skeletal bone tissues.

Key words: bone defect, bone substituting materials, osteoinduction, osteoconduction, osteointegration, remodeling.

 

Более 4 тыс. лет прошло после первой процедуры костной пластики [1]. По данным 2014 г., около 4 млн лечебных процедур зарегистрировано с применением ауто- и аллокости в мире [2]. И за последние годы отмечается тенденция к увеличению, в связи с чем возрастают потребности в костнозамещающих материалах [3]. Ни один существующий искусственный костнозамещающий материал не способен полностью повторить структуру, состав и свойства костной ткани [4]. Аутокость является «золотым стандартом» для костной пластики, а первой альтернативной аутокостью по праву считаются костные аллотрансплантаты, но применение их в свежем, или чаще свежезамороженном виде, несет за собой риски передачи инфекций и развития иммунных реакций [1]. Обработанные и стерилизованные материалы на основе аллокости в настоящее время приобретают все большую популярность, это связано с развитием и внедрением новых технологий, позволяющих сохранять естественные, присущие костной ткани, свойства [5].

Остеоинтеграция и ремоделирование имплантированного материала – сложный биологический процесс взаимодействия с организмом реципиента [6, 7]. При создании материалов для реконструктивных операций на скелете большое значение имеют выполнение доклинического анализа и изучение особенностей течения его основных этапов, поэтому использование модели на животных является традиционным способом как в рамках обязательного доклинического тестирования, так для формирования понимания и получения новой информации в ходе научного поиска.

Цель исследования – оценить в эксперименте in vivo особенности резорбции, остеоинтеграции и ремоделирования остеозамещающих материалов, заготовленных с применением температурной и радиационной стерилизации.

Материал и методы

Все процедуры, включенные в данное исследование, были рассмотрены и утверждены локальным этическим комитетом ФГБУ «РНИИТО имени Р.Р. Вредена» на предмет соответствия этическим принципам.

Обработка и стерилизация костной ткани. Для изготовления костнопластического материала использовалась костная ткань головки бедра, резецированная в ходе операции первичной артропластики тазобедренного сустава от пациентов-доноров. Костнопластический материал изготавливался двумя способами – термическая обработка в системе Telos (Lobator SD-2) [8] и экспериментальным способом циклической очистки и стерилизации ионизирующим излучением.

Очистка по экспериментальной методике осуществлялась циклическим способом, включала три этапа – на первом и втором этапе выполняли многократную, последовательную отмывку костных элементов с использованием ультразвуковой кавитации, интенсивного перемешивания в шейкере, центрифугирование. Далее лиофилизированы в сублимационной установке на HETO PowerDry PL3000 (Thermo Fisher Scientific, США), упакованы в двойную полиэтиленовую упаковку для радиационной стерилизации (КЛИНИПАК, Россия) стерилизованы на установке линейного ускорителя электронов УЭЛР-10-10-С2 дозой излучения 25 кГр. Тепловая стерилизация включала пастеризацию блоков кости, помещенных в изолированный контейнер в растворе NaCl 0,9% в установке Lobator SD-2 (TELOS, Германия). Продолжительность цикла стерилизации составляла 94 мин, пиковая температура стерилизации (82,5 °C) была выдержана в центре головки в течение 15 мин [8].

Исследование in vivo выполнено на 24 половозрелых кроликах весом 2 500–2 800 г в условиях вивария ФГБУ «РНИИТО имени P.P. Вредена» Минздрава России. Содержание и использование лабораторных животных выполняли в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (counici of European communities derective 86/609/ESS, Страсбург, 1986 г.) и требованиями «ИСО 10993-2». Животные были распределены на две группы в зависимости от используемого костнопластического материала. Группа № 1 – экспериментальная (n=12), где применяли материал, заготовленный по экспериментальной методике, и группа № 2 – контрольная (n=12), где для пластики использовали материал, заготовленный методом тепловой пастеризации. Сроки наблюдения составили 7, 21, 45, 90 суток. Оперативное вмешательство проводили на обеих задних конечностях в условиях операционной вивария. Дефект формировали с медиальной стороны проксимального метаэпифиза большеберцовой кости костным бором диаметром 8 мм, после чего выполняли пластику костной крошкой.

Морфологические исследования. Экспериментальный материал фиксировали в 10% формалине (рН 7,4), декальцинировали в 25% растворе соли органической кислоты «Трилон Б» в течении 72 ч, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации с использованием установки проводки материала Microm STR-120 (Micron Technology, США) и заливали в парафин, применяя заливочную станцию Leica (Германия). Срезы толщиной 5–7 мкм получали с помощью санного микротома Leica (Германия). Окраску проводили гематоксилином и эозином согласно протоколам производителей (Био-Витрум, Россия) с использованием автоматического линейного стейнера Raffaello Advanced (DIAPATH, S.p.A., Италия) и по Маллори. Микроскопическое исследование и фотодокументирование проводили с помощью светового микроскопа «Leica» (Германия), оснащенного цифровой камерой «Nikon» (Model E950, Япония) с увеличением 40, 100, 200 и 400 раз.

Результаты

Послеоперационный период протекал без особенностей, в первые сутки наблюдения у всех животных наблюдался умеренный отек в зоне операции, который регрессировал к третьим суткам после операции. Клинических признаков воспаления, инфицирования не было, швы состоятельны на всех сроках наблюдения. Раны заживали первично.

Микроскопическая картина на первом сроке (7 суток) в обеих группах была идентична и характеризовалась последствиями операционной травмы: область дефекта была равномерно заполнена тканевым детритом, фрагментами имплантата и кортикальной пластинки среди кровоизлияний и фибрина (рис. 1). При использовании экспериментального материала у части животных на этом сроке в клеточно-волокнистой ткани костномозгового канала определяются признаки десмального остеогенеза с образованием тонких остеоидных балочек (рис. 1А). В одном случае наблюдались явления хондрального остеогенеза в виде костно-хрящевой мозоли, выраженной преимущественно по периосту, что объясняется близостью дефекта к метафизарной хрящевой пластинке, хондроциты которой пролиферируют в ответ на травму (рис. 1Б). При использовании материалов второй группы подобных явлений десмального и хондрального остеогенеза на этом сроке не было выявлено. Кроме того, в данной группе вокруг масс имплантата была более выражена клеточная воспалительная инфильтрация (рис. 1Г). Кортикальные пластинки реагировали на травму дистрофическими и некротическими изменениями одинаково в обеих группах (рис. 1В).

Рисунок 1.

Зона дефекта костной пластики материалом экспериментальной группы Г1 (А, Б) и контрольной группы Г2 (В, Г) на 7 сутки после операции. А – окраска по Маллори, ув. х100. Б – окраска гематоксилином и эозином, ув. х200. В – окраска по Маллори, ув. х100. Г – окраска гематоксилином и эозином, ув. х100

Fig. 1

 Zone of bone graft defect by the material of the experimental group G1 (А,Б) and control group G 2 (В,Г) on the 7^th day after surgery.

A — Coloring by Mallory, increased x100. Б — Stained with hematoxylin and eosin, increased x200. В — Coloring by Mallory, increased x100. Г — Stained with hematoxylin and eosin, increased x100.

Микроскопически в зоне дефекта на 21 сутки (рис. 2) в экспериментальной группе определялся незрелый костный регенерат: слабо обызвествления губчатая кость чередовалась с рассасывающимися костными отломками (рис. 2А). Фрагменты имплантата определялись в единичном количестве. Почти во всех случаях регенерат соединял концы кортикальной пластинки за счет преимущественно периостальной мозоли (рис. 2Б). При использовании на этом сроке материала контрольной группы был выражен десмальный и эндостальный остеогенез, среди костных фрагментов и организующегося фибрина встречались частицы имплантата в виде аморфных масс (рис. 2В). Между костными балками и фрагментами разрасталась фиброзная ткань, созревающая в плотную волокнистую (рис. 2Г).

Рисунок 2.

 Зона дефекта костной пластики материалом экспериментальной группы Г1 (А, Б) и контрольной группы Г2 (В, Г) на 21-сутки после операции. А, Б – окраска по Маллори, ув. х40. В – окраска по Маллори, ув. х100. Г – окраска гематоксилином и эозином, ув. х200

Fig. 2

Zone of bone graft defect by the material of the experimental group G1 (А,Б) and control group G 2 (В,Г) on the 21^st day after surgery.

А,Б — Coloring by Mallory, increased x40. В — Coloring by Mallory, increased x100. Г — Stained with hematoxylin and eosin, increased x200

На 45 сутки наблюдения (рис. 3) микроскопически в экспериментальной группе определяется неравномерное обызвествление костного регенерата с инкапсуляцией нерезорбированнных костных фрагментов (рис. 3А) и сохранением частиц имплантата. Почти у всех животных в обеих группах формировалась непрерывная кортикальная пластинка, представленная чередующимися участками губчатой и компактной кости, утолщенной в месте дефекта, с волнистыми линиями склеивания (рис. 3Б). В контрольной группе участки губчатого строения сохранялись в костномозговом канале в месте дефекта, где между балками находились инкапсулированные костные фрагменты и частицы имплантата (рис. 3В). В фиброзных перемычках сохранялась выраженная воспалительная инфильтрация (рис. 3Г).

Рисунок 3.

Зона дефекта костной пластики материалом экспериментальной группы Г1 (А, Б) и контрольной группы Г2 (В, Г) на 45 сутки после операции. А – окраска гематоксилином и эозином, ув. х100. Б, В, Г – окраска по Маллори, ув. х100

Fig. 3

Zone of bone graft defect by the material of the experimental group G1 (А,Б) and control group G 2 (В,Г) on the 45^th day after surgery.

A — Stained with hematoxylin and eosin, increased x100. Б,В,Г — Coloring by Mallory, increased x100.

На 90 сутки гистоморфологическая картина (рис. 4) в обеих группах показала формирование кости как органа у всех экспериментальных животных. Однако у животных экспериментальной группы костномозговой канал был заполнен костным мозгом, наблюдалась резорбция имплантата (рис. 4А). В контрольной группе в ряде случаев в костном мозге имелся инкапсулированный очаг с остатками имплантата и нерезорбированных костных фрагментов (рис. 4Б). Кроме того, в фиброзной капсуле очага и в нем сохранялась воспалительная инфильтрация (рис. 4В, Г).

Рисунок 4.

 Зона дефекта костной пластики материалом экспериментальной группы Г1 (А, Б) и контрольной группы Г2 (В, Г) на 90 сутки после операции. А – окраска по Маллори, ув. х40. Б – окраска гематоксилином и эозином, ув. х40. В, Г – окраска гематоксилином и эозином, ув. х100

Fig. 4

Zone of bone graft defect by the material of the experimental group G1 (А,Б) and control group G 2 (В,Г) on the 90^th day after surgery.

A — Coloring by Mallory, increased x40. Б — Stained with hematoxylin and eosin, increased x40. В,Г — Stained with hematoxylin and eosin, increased x100

Обсуждение

В ходе проведенного эксперимента in vivo было установлено, что, несмотря на восстановление кости как органа к концу срока исследования, методы обработки и стерилизации исследуемых костнопластических материалов оказывали влияние на течение процессов остеоинтеграции и ремоделирования [9]. Во-первых, наличие остаточных органических компонентов после термической стерилизации вызывало воспалительную реакцию, которая сопровождала весь процесс костного ремоделирования и протекала до 90 суток эксперимента с формированием фиброзной капсулы, подобные данные приводят и другие авторы [10]. Во-вторых, формирование зрелой костной ткани отмечено на 21 сутки в контрольной и на 45 сутки – в экспериментальной группах. В-третьих, динамика тканевых изменений при имплантации лиофилизированного материала показала, что он обладает остеоиндуктивным потенциалом – уже на первой неделе на фоне начала резорбции в очаге воспаления стимулирует помимо эндостального десмальный остеогенез в клеточно-волокнистой ткани костно-мозгового канала. Полученные нами результаты совпадают с данными, приведенными в исследовании Г.П. Тер-Асатурова с соавторами [11], которые также описывали остеоиндуктивный потенциал лиофилизированных костнопластических материалов.

Выводы

Таким образом, методы обработки и стерилизации костных тканей оказывают влияние на течение процессов резорбции, остеоинтеграции и ремоделирования полученного материала и изменяют его остеокондуктивные, остеоиндуктивные характеристики в ходе взаимодействия с организмом реципиента после имплантации при реконструктивно-пластических вмешательствах на костных тканях опорного скелета. Все это делает необходимым тщательное исследование свойств заготавливаемых материалов перед их внедрением в клиническую практику для формирования четких показаний и рекомендаций по их применению. Выявленный воспалительный процесс в перифокальных тканях после имплантации материала, изготовленного методом тепловой стерилизации, свидетельствует, в первую очередь, о необходимости предварительной отмывки костнозамещающего материала от органических компонентов. Материал, заготовленный методом циклической очистки и стерилизованный радиацией, продемонстрировал выраженные остеоиндуктивные свойства, а использованная методика предварительной очистки до минерально-коллагенового каркаса предполагает возможность использования его в качестве скаффолда для клеточных культур или биологически-активных веществ, стимулирующих остеогенез. В тоже время полученные данные о формировании кости как органа к концу срока исследования в обеих экспериментальных группах животных дают основания для применения изученных костнозамещающих материалов в клинической практике ортопедов, нейрохирургов-вертебрологов.

Воробьёв К.А. – http:/orcid.org/0000-0001-5757-2841
Божкова С.А. – http:/orcid.org/0000-0002-2083-2424
Нетылько Г.И. – http:/orcid.org/0000-0001-5074-6204

ЛИТЕРАТУРА

1. Nandi S.K., Roy S., Mukherjee P., Kundu B. et al. Orthopedic applications of bone graft and graft substitutes: a review // Indian J Med Res. – – 132. – P. 15–30.
2. Henkel J., Woodruff M.A., Epari D.R. et al. Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions – A 21st Century Perspective // Bone Res. – – № 1 (3). – P. 216–248.
3. Мухаметов У.Ф., Мухаметов Ф.Ф., Сулейманов Я.Н. и др. Некоторые аспекты ревизионного эндопротезирования тазобедренного сустава. Пластика костных дефектов губчатыми аллоплантами // Гений ортопедии. – 2016. – № 4. – С. 29–35.
4. Воробьёв К.А., Божкова С.А., Тихилов Р.М. и др. Современные способы обработки и стерилизации аллогенных костных тканей (обзор литературы) // Травматология и ортопедия России. – 2017. – Т. 23, №3. – С. 134–147.
5. Gabriel Fernandez de Grado, Laetitia Keller, Ysia Idoux-Gillet et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management // J Tissue 2018, Jan-Dec; 9: 2041731418776819. Published online 2018, Jun4.
6. Деев Р.В., Дробышев А.Ю., Бозо И.Я. Ординарные и активированные остеопластические материалы // Вестник травматологии и ортопедии имени Н.Н.Приорова. – 2015. – № 1. – С. 51–69.
7. Gupta A., Kukkar N., Sharif K. et al. Bone graft substitutes for spine fusion: A brief review // World J Orthop.– 2015, Jul 18. – № 6 (6). – P. 449–456.
8. Pruss A., Kao M., Von Garrel T. et al. Virus inactivation in bone tissue transplants (femoral heads) by moist heat with the «Marburg bone bank system» // Biologicals. – 2003. – № 31 (1). – P. 75–82.
9. Jawed A., Siddiqui and Nicola C. Partidge. Physiological Bone Remodeling: systemic regulation and growth factor involvement // Physiology (Bethesda).– 2016. – № 31 (3). – P. 233–245.
10. Vastel L., Masse C., Mesnil P. et al. Comparative ultrasound evaluation of human trabecular bone graft properties after treatment with different sterilization procedures // J Biomed Mater Res B Appl Biomater. – – № 90 (1). – P. 430–437.
11. Тер-Асатуров Г.П., Лекишвили М.В., Бигвава А.Т. и др. Сравнительное экспериментально морфологическое исследование эффективности биологических остеопластических материалов в замещении костных дефектов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2012. – Т. 7, № 1. – С. 81–85.

REFERENCES

1. Nandi S.K., Roy S., Mukherjee P., Kundu B. et al. Orthopedic applications of bone graft and graft substitutes: a review. Indian J Med Res, 2010, no. 132, pp. 15-30.
2. Henkel J., Woodruff M.A., Epari D.R. et al. Bone Regeneration Based on Tissue Engineering Conceptions — a 21st Century Perspective. Bone Res, 2013, no. 1(3), pp. 216-248
3. Mukhametov U.F., Mukhametov F.F., Suleimanov I.N., Nagaev R.I., Nigmatullin R.T., Shangina O.R. Some aspects of the hip arthroplasty revision. Bone defect plasty with sponge allografts. Genij Ortopedii, 2016, no. 4, pp. 29-35 (in Russ)
4. Vorobyоv K.A., Bozhkova S.A., Tikhilov R.M., Cherny A.Zh. Current Methods of processing and Sterilization of Bone Allografts (Review). Travmatologiya i ortopediya Rossii, 2017, no. 23(3), pp. 134-147(in Russ)
5. Gabriel Fernandez de Grado, Laetitia Keller, Ysia Idoux-Gillet et al. Bone substitutes: a review of their characteristics, clinical use, and perspectives for large bone defects management. J Tissue Eng, 2018
6. Deev R.V., Drobyshev A.Yu., Bozo I.Ya. Ordinary and Activated osteoplastic materials. Vestnik travmatologii i ortopedii im. N.N. Priorova, 2015, no. 1, pp. 51-69(in Russ)
7. Gupta A., Kukkar N., Sharif K. et al. Bone graft substitutes for spine fusion: A brief review. World J Orthop., 2015, vol. 6(6), pp. 449-456.
8. Pruss A., Kao M., Von Garrel T. et al. Virus inactivation in bone tissue transplants (femoral heads) by moist heat with the Marburg bone bank system. Biologicals, 2003, vol. 31(1), pp. 75-82
9. Jawed A., Siddiqui and Nicola C. Partidge. Physiological Bone Remodeling: systemic regulation and growth factor involvement. Physiology (Bethesda), 2016, vol. 31(3), pp. 233-245.
10. Vastel L., Masse C., Mesnil P. et al. Comparative ultrasound evaluation of human trabecular bone graft properties after treatment with different sterilization procedures. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2009, vol. 90(1), pp. 430-437.
11. Ter-Asaturov G.P., Lekishvili M.V., Bigvava A.T., Adzhiev K.S., Ryabov A.Yu., Yurasova Yu.B. Comparative experimental and morphological study of biological osteoplastic materials in bone defects repair. Kletochnaya trasplantologiya i tkanevaya inzheneriya, 2012, vol. 7, no. 1, pp.81-85