УДК 617.7-007.681 

В.Г. ЛИХВАНЦЕВА¹_, И.В. КОВЕЛЕНОВА⁴, М.В. СОЛОМАТИНА², БЕН РЕЖЕБ АМИН¹, А.Г. ГАБИБОВ³, А.А. БЕЛОГУРОВ³

¹Институт повышения квалификации ФМБА России, 125371, г Москва, Волоколамское шоссе, д. 91

²Клиническая больница им. Н.А. Семашко, 390005, г. Рязань, ул. Семашко, д. 3

³Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10

⁴Ульяновская областная клиническая больница, 432017, г. Ульяновск, ул. III Интернационала, д. 7 

Лихванцева Вера Геннадьевна ― доктор медицинских наук, профессор кафедры глазных болезней, тел. +7-916-659-41-56, e-mail: likhvantseva-4@yandex.ru

Ковеленова Ирина Викторовна ― кандидат медицинских наук, заведующая отделением микрохирургии глаза, тел. +7-927-634-30-09, e-mail: kiv-06@list.ru

Соломатина Мария Викторовна ― врач-офтальмолог 2-го глазного отделения, тел. +7-910-568-83-79, e-mail: maria.vikto@gmail.com

Бен Режеб Амин ― аспирант кафедры глазных болезней, тел. +7-977-291-99-86, e-mail: coachamine@hotmail.ru

Габибов Александр Габибович ― доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН, руководитель лаборатории биокатализа, тел. (495) 727-38-60, e-mail: gabibov@mx.ibch.ru

Белогуров Алексей Анатольевич ― кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биокатализа, тел. (495)-727-38-60, e-mail: belogurov@mx.ibch.ru

Авторы провели серологические исследования с количественной оценкой 9 антител к белкам, участвующим в антиапототической защите, контроле иммуномолекулярного гомеостаза и тканевого гомеостаза, у 82 больных первичной открытоугольной глаукомой. Было установлено, что глаукома развивается на фоне синхронного дефицита антител к белкам, контролирующим сохранность цитоскелета в клетке: антител к актину, фодрину и тимозину ß4. Дефицит антител нарастал от стадии к стадии. Параллельно возрастали иммуномолекулярные признаки апоптотической гибели клеток в виде растущего расхода антител к специфическим антигенам: GADPH, родопсину, ENO, NSE-1. Манифестация заболевания сопровождалась выбросом каталитических антител к MBP, участвующих в деструкции аксонов, и стимуляцией продукции антител к кристаллинам, отвечающим за репаративные процессы и антиоксидантную защиту в клетке. Полученные данные раскрывают возможности молекулярной диагностики и оценки эффективности глаукомы.

Ключевые слова: иммуномолекулярные маркеры, первичная открытоугольная глаукома, сыворотка крови, диагностика.

 

V.G. LIKHVANTSEVA¹_, I.V. KOVELENOVA⁴, M.V. SOLOMATINA², BEN REDJEB AMIN¹, A.G. GABIBOV³, A.A. BELOGUROV³

¹Institute of Advanced Training of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, 91 Volokolamskoe Road, Moscow, Russian Federation, 125371

²Clinical Hospital named after N.A. Semashko, 3 Semashko St., Ryazan, Russian Federation, 390005;

³Institute of Bioorganic Chemistry named after academicians M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov of the Russian Academy of Sciences, 16/10 Miklukho-Maklai St., Moscow, Russian Federation, 117997

⁴Ulyanovsk Regional Clinical Hospital, 7 III Internatsyonala St., Ulyanovsk, Russian Federation, 432017

Serological mapping of antibodies in primary open-angle glaucoma 

Likhvantseva V.G. ― D. Med. Sc., Professor of the Department of Eye Diseases of the Federal Medical-Biological Agency, tel. +7-916-659-41-56, e-mail: likhvantseva-4@yandex.ru

Kovelenova I.V. ― Cand. Med. Sc., Head of the Department of Eye Microsurgery, tel. +7-927-634-30-09, e-mail: kiv-06@list.ru

Solomatina M.V. ― ophthalmologist of the 2^nd Ophthalmology Department, tel. +7-910-568-83-79, e-mail: maria.vikto@gmail.com

Ben Redjeb Amin ― postgraduate student of the Department of Eye Diseases, tel. +7-977-291-99-86, e-mail: coachamine@hotmail.ru

Gabibov A.G. ― D. Chem. Sc., Professor, corresponding member of the RAS, Head of the Biocatalysis Laboratory, tel. (495) 727-38-60, e-mail: gabibov@mx.ibch.ru

Belogurov A.A. ― Cand. Chem. Sc., Senior Researcher of the Biocatalysis Laboratory, tel. (495) 727-38-60, e-mail: belogurov@mx.ibch.ru

The authors have conducted serological studies with the quantitative assessment of 9 anti-SP antibodies participating in anti-apoptotic protection, control of immunomolecular homeostasis and tissue homeostasis in 82 patients with primary open-angle glaucoma. It was established that glaucoma develops against the background of simultaneous deficiency of anti-SP antibodies that control integrity of cellular cytoskeleton: anti-actin, anti-fodrin, and anti-thymosin ß4 antibodies. Antibodies deficiency grew. Simultaneously increased immunomolecular signs of apoptotic cellular death in the form of rising antibodies consumption to specific antigens ― GADPH, rhodopsin, ENO, NSE-1 ― have increased. Manifestation of the disease was accompanied by release of anti-MBP catalytic antibodies participating in destruction of axons and stimulation of production of anti-crystallin antibodies responsible for reparative processes and antioxidative protection in the cell. Obtained data unveil the opportunities of molecular diagnostics and evaluation of glaucoma efficiency.

Key words: immunomolecular markers, primary open-angle glaucoma, blood serum, diagnostics.

 

Современные лабораторные диагностические технологии позволили выйти на новый ― иммуномолекулярный уровень диагностики многих заболеваний. К настоящему дню найдены и нашли широкое применение в ранней диагностике заболеваний центральной нервной системы молекулярные маркеры болезни Альцгеймера и Паркинсона: бета-амилоид (Aβ) и тау-белок [1-3]. Не меньшей популярностью пользуются маркеры повреждения мозговой ткани: S100, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP), нейронспецифическая енолаза (NSE), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) [4]. Заметим, с одинаковым успехом в серологической диагностике можно использовать как количественные показатели белков, так и антител к ним. В этом аспекте, глаукома, как нейродегенеративное заболевание, практически не изучена. Не раскрыты возможности ранней иммуно-молекулярной серологической диагностики и прогнозирования, отсутствуют критерии оценки эффективности лечения.

 

Цель исследования ― изучить серологические показатели антител и возможности диагностики на их основе при первичной открытоугольной глаукоме (ПОУГ).

 

Материалы и методы

Обследовали 82 пациента с впервые выявленной, нелеченной ПОУГ в возрасте от 41 до 84 лет. Стадию ПОУГ устанавливали в соответствии с Международными стандартами диагностики, опираясь на клинические данные (состояние переднего отрезка глаза, изменения на глазном дне), результаты тонометрии, тонографии, компьютерной периметрии, оптической когерентной томографии.

Результаты сравнивали с данными группы контроля: 25 здоровых добровольцев аналогичного возрастного коридора без офтальмопатологии, клинических признаков системных аутоиммунных заболеваний и отягощенного анамнеза.

Антитела (АТ) в сыворотке крови (СК) определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА, sandwich ELISA). На первом этапе в лунки планшета помещали 50 мкл раствора смеси 100 мМ карбоната и гидрокарбоната натрия pH 9,0, содержащего 0.1 мкг соответствующего АГ, инкубировали ночь при +4ºС. Лунки трижды промывали раствором PBS-0.15% Tween 20, блокировали 1 час раствором 2% BSA в карбонатном буфере при +37ºС. Далее блокирующий раствор удаляли, лунки вновь промывали раствором PBS-0.15% Tween 20. Вносили разведения сыворотки (1:100) от 1 до 0,0005 мкг в 50 мкл раствора PBS-0.5% BSA-0.15% Tween 20, затем инкубировали 1 час при +37ºС, после чего трижды промывали. В соответствующие лунки добавляли по 50 мкл коньюгата АТ козы, специфичных к Fc-фрагменту иммуноглобулина G (IgG) человека (1:4000). Инкубировали в течение 1 часа при +37ºС, промывали х5 раз. Окрашивали, добавляя во все лунки по 50 мкл раствора тетраметилбензидина. Реакцию останавливали 10% раствором фосфорной кислоты. Концентрацию АТ в сыворотке отражал спектрофотометрический показатель в условных единицах оптической плотности. Исследования проводили с помощью автоматизированной станции JANUS (PerkinElmer, USA). Объектом исследования служили: сыворотка (n=84) больных ПОУГ; сыворотка (n=25) здоровых лиц контроля. Использовали 3 маркера нейрональной дифференцировки: АТ к NSE, ENO-1 и MBP (Abcam, Cambridge,UK), 3 маркера, отражающие состояние антиапоптотической защиты нейронов: АТ к актину, α-фодрину и Тβ4 (Abcam, Cambridge,UK). Уровень развившегося апоптоза нейронов сетчатки отражали количественные показатели АТ к GADPH и родопсину (Abcam, Cambridge,UK). Состояние напряженности иммунитета и возможности клетки к репаративному процессу отражали антитела к кристаллину (Abcam, Cambridge,UK).

Результаты исследования анализировали с помощью пакета прикладных статистических программ SAS (Statistical Analysis System, SAS Institute Inc., США). Рассчитывали средние значения, стандартные отклонения, ошибки среднего значения, медианы, интерквартильные расстояния и др.

 

Результаты

В группе ПОУГ присутствовали 46 женщин (56,10%) и 36 мужчин (43,90%) в возрасте от 48 до 82 лет. Их средний возраст составил Мср=67,95±0,97 (Мср=M±m). В группе контроля (25 человек) присутствовали 16 мужчин (64%) и 9 женщин (36%), средний возраст которых составил Мср=65,49±2,00 (Мср=M±m).

На 28 глазах (n=164, 17,1%) имела место 1 стадия заболевания, на 50 (30,6%) ― 2 стадия, на 42 (25,6%) ― 3 стадия, на 34 (20,7%) ― 4 стадия; в 10 глазах ПОУГ не проявилась. При анализе системных иммунных показателей стадию ПОУГ выставляли по худшему глазу в соответствии с правилами статистического анализа системных проявлений билатеральных заболеваний парных органов (табл. 1).

 

Таблица 1.

Количественные показатели антител на разных стадиях первичной открытоугольной глаукомы

Показатели системного иммунитетаМ±m	Первичная открытоугольная глаукома				Контроль(n=25)
	1стадия(n=28)	2 стадия(n=50)	3 стадия(n=42)	4 стадия(n=34)
Антителак ENO-1	0.32±0,02**	0.36±0.04**	0.27±0,0.04**,♯	0.31±0.01**	0,56±0,19
Антителак NSE	0.31±0,04*	0.27±0.02**	0.28±0,02**	0.39±0.08	0,37±0,08
Антителак MBP	0.60±0,03*	0.42±0.08*	0.52±0,05♯♯	0.31±0.01**,♯♯	0,49±0,20
АТк GAPDH	0.33±0,03	0.43±0.09	0.72±0,02**	0.36±0.09	0,36±0,15
АТ к родопсину	0.82±0,05**	0.96±0.07**	1.64±0,03**,#	1.15±0.02#	1,13±0,13
АТ к актину	0.36±0,07**	0.29±0.02**	0.54±0,06#	0.29±0.03*	0,50±0,21
АТ к фодрину	0.36±0,02	0.30±0.03	0.26±0,04**,#	0.25±0.03**,#	0,39±0,17
АТ к Тβ4	0.15±0,04**	0.16±0.01**	0.17±0,06*	0.15±0.03**	0,23±0,11
АТ к ᾶ-кристаллину	1.01±0,04**	1.20±0.06**	1.26±0.13**	1.34±0.05**,♯	0,29±0,16

Примечание: достоверность различий от контроля: * ― р<0.05, ** ― р<0,001; достоверность отличий от 1 стадии: ^♯ ― р<0.05, ^♯♯ ― р<0,001

 

Было установлено, что ПОУГ манифестирует на фоне сочетанного системного иммунодефицита в виде снижения уровня АТ к NSE и АТ к ENO-1 (табл. 1). Дефицит АТ к ENO-1 и АТ к NSE нарастал по мере повышения стадии заболевания, на третьей стадии он был выше, чем на первой, а на четвертой выше, чем на второй. Уровень АТ к NSE коррелировал с глубиной повреждения нейронов сетчатки (коэффициент корреляции по Спирману r=0,6872, p<0,001). Далеко-зашедшая стадия ПОУГ характеризовалась небольшим приростом АТ к NSE, что, по-видимому, можно трактовать как прекращение поступления в системный кровоток антигена (АГ) в связи с тотальной гибелью нейронов (ганглиозных клеток) сетчатки, экспрессирующих NSE, и расхода антител на связывание АГ.

На этапе манифестации ПОУГ имел место выброс АТ к MBP, обладающих каталитическими функциями. Учитывая, что на этом этапе заболевания, в клинике ПОУГ доминирует офтальмогипертензия, полагаем, что первоначальной аутоиммунной агрессии этих антител подверглись миелинизированные аксоны периферической нервной системы, регулирующие секрецию внутриглазной жидкости отростками цилиарного тела, контролирующие тонус трабекулярной сети и отток по ней. На третьей стадии пик этих антител совпал с падением центральной остроты зрения, что, по-видимому, можно объяснить каталитической деструкцией миелинизированных аксонов зрительного нерва.

ПОУГ развивалась на фоне аберрантного дефекта иммунной системы ― дефицита одновременно двух антител к цитоскелетным белкам: актину и фодрину. Переход от 1 ко 2-й стадии ПОУГ ассоциировался со снижением уровня АТ к актину на 38-42% от нормы, на 3-й стадии имел место небольшой (8% от нормы) их выброс в периферический кровоток, который вновь сменялся на далеко-зашедшей стадии глубоким дефицитом (42% от нормы). Антитела к ядерному белку фодрину последовательно снижались от 1 до 4-й стадии, опускаясь ниже границы нормы на 7,7-35,8%.

Известно, что пептид Тβ4 сосредоточен в ядре, колокализован с актиновыми филаментами, при апоптозе выходит из ядра и распределяется в цитоплазме. Вместе с актином и фодрином, Тβ4 играет важную роль в поддержании цитоскелета клеток, регулируя полимеризацию актина и блокируя апоптоз. Усиливая толерантность нейронов к гипоксии, он снижает их чувствительность к апоптозу. Доказано, что манифестация клинических признаков ПОУГ развивается на фоне дефицита АТ к Тβ4, который при переходе от 1 к 3-й стадии сокращается с 34,8 до 26,4% от нормы, возвращаясь на терминальной стадии к показателям второй стадии заболевания. Учитывая ядерную локализацию белка, условие для перемещения в цитоплазму ― апоптоз, логично предположить, что дефицит АТ к Тβ4 ассоциируется с утратой функций пептида в клетке и повышением ее чувствительности к апоптозу.

Синхронный дефицит АТ к актину, фодрину и Тβ4 сопровождался ростом АТ к GADPH ― белку, колокализованному с актиновыми филаментами, являющемуся индикатором ранних стадий апоптоза нейронов. Стимуляция продукции АТ к GADPH начинается со второй стадии и достигает максимума на третьей стадии ПОУГ. Учитывая ядерную локализацию белка, его выход в цитоплазму на этапе состоявшегося апоптоза, можно думать о развитии массивного апоптоза. Это предположение подтверждается параллельной постадийной динамикой АТ к родопсину: от стадии к стадии имел место количественный прирост АТ к родопсину. Вполне очевидно, что количество АТ коррелирует с количеством самого родопсина. И поскольку родопсин отражает интенсивность фотохимических процессов зрительного каскада в фоторецепторах, нарастает на фоне фотостресса, не содержится в иных нейронах сетчатки, то можно утверждать, что в триггерных механизмах ПОУГ играет важную роль фотостресс. По-видимому, благодаря ему, повышается уровень активных форм кислорода ― универсальный механизм реорганизации актинового цитоскелета. Доказано, что окисление актина приводит к утрате его способности к полимеризации. В условиях слаженной работы иммунно-молекулярного гомеостаза восстановительные системы (каталазы, глутатион пероксидазы и др.) быстро элиминируют активные формы кислорода. Однако снижение антиапоптотической защиты клетки в виде дефицита АТ к цитоскелетным белкам, по-видимому, нарушает мебранно-восстановительные, транспортные процессы в клетке, повышая ее чувствительность к апоптозу.

Напряженность системного иммунитета отражает уровень антител к ᾶ-кристаллину. Известно, что белок ᾶ-кристаллин выполняет важную роль в поддержании прозрачности хрусталика и светопреломляющих свойств глаза, обеспечивает защиту нейронов от ультрафиолетового облучения, окислительного стресса и фотостресса, защищает от апоптоза. От стадии к стадии заболевания происходит многократное (в 2-4,6 раза) увеличение уровня АТ к ᾶ-кристаллину. Антительное связывание белка, обладающего антиапоптотической протекторной и шапероноподобной активностью, по-видимому, приводит к ингибированию или даже устранению его протекторных свойств. Полагаем, что выявленный факт может способствовать быстрому прогрессированию катарактогенеза при ПОУГ.

 

Заключение

Проведенные иммунологические исследования представляют первое исследование в Российской Федерации с применением широкого спектра маркеров (n=9), отражающих, с одной стороны, состояние антиапоптотической защиты нейронов, с другой стороны ― масштабность разрушений высокодифференцированной нервной ткани ― сетчатки и зрительного нерва. Выбор маркеров определялся их установленной ролью в иммуно-молекулярном гомеостазе клеток нейронального происхождения.

Известно, что актиновый цитоскелет нейронов является динамичной системой, реагирующей на внешние воздействия и внутриклеточные процессы быстрой перестройкой пространственной организации своих структур или разборкой цитоскелета. Вместе с моторными белками актиновые филаменты играют решающую роль в клеточном делении и секреции [5]. Актиновый цитоскелет аксонов периферической нервной системы и аксонов ганглиозных клеток сетчатки принимает активное участие в внутриклеточном транспорте и проведении внутриклеточных сигналов, играет важную роль в процессах эндоцитоза и фагоцитоза. Указанные процессы ― основа фотохимических реакций, протекающих в фоторецепторах сетчатки. Актин является основным белковым компонентом цитоскелета, составляет 10-15% от всех клеточных белков. Другой член актинового семейства ― Тβ4 поддерживают уровень глобулярного актина, играя роль буфера. Фодрин ― второй по значимости белок цитоскелета нейронов. Он привязывает нити актина к плазматической части мембраны клетки. Фодрин является мишенью для каспазы-3 и расщепляется на ранних стадиях апоптоза, приводя вначале к структурным перестройкам клеточной мембраны (на мембране появляются многочисленные пузыри, клетка «как будто вскипает»), а затем, ― к разрушению цитоскелета (происходит центростремительное сокращение актинового кольца) [6]. Комплекс этих белков контролирует сохранность цитоскелета нейронов. Любые качественные и количественные изменения этих белков могут привести к снижению антиапоптотической защиты клетки. Ингибирование, инактивация их функций путем антительного связывания могут не только ослабить антиапоптотическую защиту, но и повысить ее чувствительность к апоптозу. На этом фоне даже незначительные проапоптотические стимулы (ишемический стресс, фотостресс) могут стать триггером к запуску апоптоза.

Согласно современной концепции аутоиммунитета, умеренный иммунный ответ на свои собственные АГ ― обязательное физиологическое явление или критерий нормального функционирования ИС. Адекватный иммунный ответ ― предпосылка нормальной регуляции и синхронизации клеточных, гуморальных функций иммунной системы и морфогенеза. В здоровом организме существуют гомеостатические механизмы, предотвращающие запуск патологического процесса. Фоновые значения антител к нейрогенным антигенам в популяции здоровых лиц являются тому подтверждением (табл. 1). Не вызывает сомнений и утверждение, что циркулирующие антитела связывают комплементарный им антиген. Выдвинута гипотеза, что апоптоз ганглиозных клеток сетчатки при ПОУГ протекает на фоне предсуществующих аберрантных дефектов иммунитета, маркерами которых служат цитотоксические аутоАТ, направленные к АГ сетчатки [7]. По мнению M.B. Wax, некоторые из АТ к АГ сетчатки, могут проникать внутрь нейронов и вызвать их апоптоз. Раскрыты механизмы проникновения их внутрь клетки [8]. Полагают, что доступ АТ к целевым АГ облегчается при нарушении гематоофтальмического барьера (ГОБ). В свою очередь ГОБ ослаблен на глаукомных глазах с перипапиллярной хориоретинальной атрофией [8, 9]. В наших исследованиях, выявленный дефицит антител к NSE на ранних стадиях ПОУГ может отражать исходный дефект одновременно гематоэнцефалического и гематоофтальмического барьеров. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что на этапе манифестации первичной открытоугольной глаукомы у пациента имеет место ослабление антиапоптотической защиты.

Попытки системного иммунитета по восстановлению иммунно-молекулярного гомеостаза, проявляющиеся повышением уровня продукции антител к кристаллинам и к Тβ4, не увенчаются успехом. Освобождение Тβ4 из комплекса с актином и выход его в кровоток служит сигналом для запуска иммунной системы и стимуляции антителообразования. Количество АТ отражает уровень циркулирующего АГ. Минимальный дефицит АТ к Тβ4 ассоциируется с 3 стадией ПОУГ. Именно на этой стадии прослеживается попытка иммунной системы восстановить антиапоптотическую защиту, которая ассоциируется с повышением продукции АТ к актину. Однако синхронный выброс АТ к GADPH и АТ к родопсину свидетельствуют о ее неэффективности. Белок ENO-1 признан маркером заболеваний сетчатки, протекающих с аутоиммунными реакциями [7, 9]. Клинически значимое снижение серологического уровня антител к ENO-1 на этапе манифестации ПОУГ, может свидетельствовать о расходе антител на связывание АГ и подтвердить процессы разрушения высокодифференцированных нейронов сетчатки. В комплексе с избытком каталитических антител к основному белку миелина (MBP) на этапе развития офтальмогипертензии и снижения центрального зрения раскрываются возможности прогнозирования риска развития глаукомы и возможности оценки эффективности терапевтических препаратов, направленных на восстановление клеточного гомеостаза.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Cohen I.R. Biomarkers, self-antigens and the immunological homunculus / I.R. Cohen // Autoimmun. ― 2007. ― Vol. 29. ― P. 246-249.
2. Mudher A. Alzheimer’s disease-do tauists and baptists finally shake hands? / Mudher, S. Lovestone // Trends Neurosci. ― 2002. ― Vol. 25, №1. ― P. 22-26.
3. Shen Z.X. Brain cholinesterases: II. The molecular and cellular basis of Alzheimer’s disease / X. Shen // Med. Hypotheses. ― 2004. ― 63 (2). ― P. 308-21.
4. Nistor M. Alpha- and beta-secretase activity as a function of age and beta-amyloid in Down syndrome and normal brain / M. Nistor, M. Don, M. Parekh et al. // Neurobiol. Aging. ― ― Vol. 28, №10. ― P. 1493-1506.
5. Минин А.А. Внутриклеточный транспорт. Принципы регуляции / А.А. Минин, А.В. Кулик // Успехи биологической химии. ― ― Т. 44. ― С. 225-262.
6. Caspase-3 is required for alpha-fodrin cleavage but dispensable for cleavage of other death substrates in apoptosis / R.U. Janicke et al. // Biol. Chem. ― 1998. ― Vol. 273. ― P. 15540-15545.
7. Wax M.B. Neurobiology of glaucomatous optic neuropathy: diverse cellular events in neurodegeneration and neuroprotection / M.B. Wax, G. Tezel // Mol. Meurobiol. ― ― Vol. 26. ― P. 45-55.
8. Wax M.B. Clinical and ocular histopathological findings in a patients with normal-pressure glaucoma / M.B. Wax, G. Tezel, P.D. Edward // Arch. Ophthalmol. ― ― Vol. 116. ― P. 993-1001.
9. Tezel G. Immunostaining of heat shock proteins in the retina and optic nerve head of normal and glaucomatous eyes / G. Tezel, R. Hernandez, M.B. Wax // Arch. Ophthalmol. ― ― Vol. 118. ― P. 511-518.