УДК 616.314.18-002.4

 Е.М. СПЕРАНСКАЯ^1,3, Л.Р. МУХАМЕДЖАНОВА^1,2, Н.Н. ГОЛУБЦОВА¹, Р.Г. КУЗНЕЦОВА⁴

¹Чувашский государственный университет имени И.Н.Ульянова, 428015, г. Чебоксары, пр. Московский, д. 15

²Учебно-методический центр «Эксклюзив-Дент», 420061, г. Казань, ул. Космонавтов, д. 42

³Республиканская стоматологическая поликлиника МЗ ЧР, 428015, г. Чебоксары, пр. Московский, д. 15

⁴Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, Оренбургский тракт, д. 138

 Сперанская Екатерина Михайловна ― ординатор по специальности стоматология терапевтическая, тел. +7-917-662-93-53, e-mail: katerina_dumspirospero@mail.ru

Мухамеджанова Любовь Рустемовна ― доктор медицинских наук, профессор кафедры пропедевтики стоматологических заболеваний и новых технологий, тел. +7-965-597-11-64, e-mail: lr71@bk.ru

Голубцова Наталья Николаевна ― кандидат биологических наук, доцент кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины, тел. +7-905-340-77-99, e-mail: golubnata@list.ru

Кузнецова Роза Гилевна ― старший научный сотрудник научно-исследовательского отдела, тел. +7-917-264-85-29, e-mail: rkb_nauka@rambler.ru

Изучен уровень экспрессии маркера клеточной адгезии Е-кадгерин и маркера пролиферации р-53 в структурах многослойного плоского ороговевающего эпителия десны пациентов, отягощенных хроническим генерализованным пародонтитом. Установлено угнетение процессов клеточной адгезии и усиление процессов пролиферации в структурах многослойного плоского эпителия десны, увеличение значений параметров (количество, высота, ширина) соединительнотканных сосочков многослойного плоского эпителия. Полученные результаты актуализируют поиск методов регуляции процессов пролиферации и адгезии в эпителиоцитах десны.

Ключевые слова: хронический генерализованный пародонтит, антиапоптотический белок p-53, маркер клеточной адгезии Е-кадгерин.

 

E.M. SPERANSKAYA^1,3, L.R. MUKHAMEDZHANOVA^1,2, N.N. GOLUBTSOVA¹, R.G. KUZNETSOVA⁴

¹Chuvash State University named after I.N. Ulyanov, 15 Moskovskiy Pr., Cheboksary, Russian Federation, 428015

²Training and methodological center «Eksklyuziv-Dent», 42 Kosmonavtov Str., Kazan, Russian Federation, 420061

³Republic Dental Polyclinic, 15 Moskovskiy Pr., Cheboksary, Russian Federation, 428015

⁴Republic Clinical Hospital of the MH of RT, 138 Orenburgskiy Trakt, Kazan, Russian Federation, 420064

 Processes of cell adhesion of periodontal tissues in inflammatory and destructive lesions

 Speranskaya E.M. ― resident doctor of the Department of Propaedeutics of Stomatologic Diseases and New Technologies, tel. +7-917-662-93-53, e-mail: katerina_dumspirospero@mail.ru

Mukhamedzhanova L.R. ― D. Med. Sc., Professor of the Department of Propedeutics of Stomatology Diseases and New Technologies, tel. +7-965-597-11-64, e-mail: lr71@bk.ru

Golubtsova N.N. ― Cand. Biol. Sc., Associate Professor of the Department of General and Clinical Morphology and Forensic Medicine, tel. +7-905-340-77-99, e-mail: golubnata@list.ru

Kuznetsova R.G. ― Senior Researcher of the Research Department, tel. (843) 231-16-20, e-mail: rkb_nauka@rambler.ru

 The levels of cellular adhesion marker E-cadherin and proliferation marker p-53 were studied in the structures of multilayered flat keratinized epithelium of the gums of patients with chronic generalized periodontitis. Inhibition of cell adhesion and increase of proliferation in the structures of multilayered flat epithelium of the gum was found, as well as the increase in the parameters (number, height, width) of connective tissue papillae of multilayered flat epithelium. The obtained results actualize the search for regulation methods of the proliferation and adhesion processes in the gingival epitheliocytes.

Key words: chronic generalized periodontitis, antiapoptotic protein p-53, marker of cell adhesion E-cadherin.

 

Cовершенствование диагностики и комплексного лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом является актуальным вопросом современной пародонтологии [1-4]. Воспаление тканей пародонта протекает с нарушением клеточного гомеостаза, что приводит к гипоксии и нарушению пролиферации, активации апоптоза, межклеточной адгезии [5]. Белок р-53 выступает в роли фактора транскрипции, регулирующий экспрессию большого количества генов, вовлеченных в арест клеточного цикла, и апоптоз в ответ на повреждение ДНК [5, 6]. Молекулы Е-кадгерина участвуют в адгезии, определяют архитектуру и дифференцировку эпителиоцитов [7, 8].

Результаты изучения значений параметров клеточной адгезии, апоптоза эпителиоцитов десны позволят улучшить раннюю диагностику хронического генерализованного пародонтита у пациентов на амбулаторном стоматологическом приеме [5].

 Цель исследования ― изучить особенности процессов апоптоза и клеточной адгезии эпителия у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом.

 Материал и методы исследования

Обследованы 20 пациентов (9 мужчин и 11 женщин в возрасте 20-36 лет) с интактным пародонтом, обратившиеся в клинику с целью оказания плановой санационной помощи (группа сравнения). Исследуемая группа представлена 21 пациентами сопоставимого гендерно-возрастного состава; пациенты исследуемой группы отягощены хроническим генерализованным пародонтитом легкой/средней степени тяжести. Пародонтологический диагноз верифицирован с использованием традиционной индексной оценки и трехмерной конусно-лучевой дентальной рентгеновской компьютерной томографии. Все пациенты исследуемой группы и группы сравнения подтвердили своё согласие на участие в исследовании.

Пациентам, участвующим в исследовании, проводился забор тканей десневого сосочка (под инфильтрационной анестезией 2% раствором лидокаина, вкол иглы при этом проводился в основание сосочка). Полученный биоматериал фиксировали в 10% забуференном растворе формалина и заливали в парафин. Из блоков изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм. Применяли общую окраску гематоксилином и эозином для определения значений параметров соединительнотканных  сосочков (количество, высоту, ширину). Для выявления маркеров p-53 и Е-кадгерина применялись иммуногистохимические методы. Иммуногистохимические исследования выполнялись в соответствии со стандартными протоколами. Тканевые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла, обработанные L-полилизином, высушивали при комнатной температуре в течение 24 часов. Окраска проводилась ручным и аппаратным способом с использованием иммуногистохимических автостейнеров AUTOSTAINER-3 60 (THERMO, Великобритания) и Leica BOND-MAX (Германия) с применением систем визуализации En-vision (DAKO, Дания) и NovoLink polymer (NovoCastra, Великобритания). В работе использованы поликлональные антитела к антиапоптотическому белку р-53 (Santa Cruze,США) [9], моноклональные антитела к Е-кадгерину (клон NCH-38) [10, 7], в качестве проявляющей тест-системы использовали набор LSAB+kit («Dako», Дания), а в качестве хромогена ― DAB+kit («Dako», Дания). Срезы были докрашены гематоксилином и заключены под покровное стекло.

Количественные морфометрические измерения интенсивности мембранных и цитоплазматических иммуногистохимических реакций выполнены с применением программы Sigma Scan Pro. Подсчитывали число p-53-позитивных эпителиоцитов на 100 клеток базального и шиповатого слоев. В результате определяли процент иммунопозитивных к p-53 эпителиоцитов.

Экспрессия маркера Е-кадгерина оценивалась качественно и количественно. Качественная оценка основана на интенсивности окрашивания плазмолеммы и цитоплазмы:

0 баллов ― окрашивание отсутствует, 1 балл ― слабое окрашивание, 2 балла ― окрашивание средней интенсивности, 3 балла ― сильное окрашивание [7]. Количественно оценивали процент Е-кадгерин-позитивных эпителиоцитов на 100 клеток каждого слоя многослойного плоского ороговевающего эпителия десны: базального, шиповатого, зернистого, рогового. В результате определяли процент иммунопозитивных к Е-кадгерину эпителиоцитов.

Полученные цифровые данные подвергали статистической обработке. По каждой группе данных рассчитывали средние арифметические величины (М) и их стандартные ошибки (m). При значениях переменных, соответствующих требованиям нормальности распределения, сравнение проводили с использованием критерия Стьюдента, не соответствующих обозначенным требованиям ― с использованием критерия Манна ― Уитни.

 Результаты исследований  

При окраске препаратов гематоксилином и эозином выявлено, что у пациентов с интактным пародонтом собственная пластинка слизистой оболочки имеет менее выраженные сосочковый и сетчатый слои по сравнению с группой  пациентов, отягощённых пародонтитом. При пародонтите увеличиваются значения параметров соединительнотканных сосочков: количество ― в 1,4 раза, высота ― в 1,7 раза, ширина ― 1,4 раза (табл. 1).

Таблица 1.

Параметры соединительнотканных сосочков десны

Группа	Количество сосочков в 1 мм²	Высота сосочков	Ширина сосочков
Группа сравнения, n=20	35,3±0,2	119,3±0,63	24,5±1,2*
Исследуемая группа, n=21	49,6±0,41	189,1±0,13	33,2±0,2*

Примечание: * ― p<0,01

Экспрессию Е-кадгерина определяли в многослойном плоском ороговевающем эпителии десны (МПОЭ): в межклеточном веществе, плазмолемме и цитоплазме эпителиоцитов десны в виде темно-коричневого окрашивания, светло-коричневого окрашивания и бледно-коричневого окрашивания. Интенсивное окрашивание межклеточного вещества у пациентов с интактным пародонтом наблюдалось в базальном и шиповатом слоях многослойного плоского ороговевающего эпителия десны (рис. 1А). Умеренное окрашивание выявлялось в роговом слое МПОЭ, слабое окрашивание ― в зернистом слое эпителия десны (рис. 1Б).

Рисунок 1.

Иммуногистохимический метод выявления Е-кадгерина. Многослойный плоский эпителий десны. Группа сравнения (А), группа с хроническим генерализованным пародонтитом (Б). 1 ― интенсивно окрашенные эпителиоциты. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 40

При пародонтите накопление Е-кадгерина преимущественно регистрировалось в плазмолемме, эпителиоциты базального, зернистого и рогового слоя имели слабое окрашивание цитоплазмы. Цитоплазма клеток шиповатого слоя имела умеренное окрашивание.

При пародонтите количество интенсивно окрашенных эпителиоцитов в базальном слое уменьшается в 4,3 раза, умеренно окрашенных ― в 2,4 раза, слабо окрашенных увеличивается в 1,2 раза. В шиповатом слое уменьшается количество эпителиоцитов с интенсивно окрашенной цитоплазмой в 2,2 раза, умеренно окрашенной ― в 1,8 раза, количество эпителиоцитов со слабо окрашенной цитоплазмой увеличивается в 1,3 раза. В зернистом слое при пародонтите эпителиоциты с интенсивно окрашенной цитоплазмой не выявляются, количество умеренно окрашенных эпителиоцитов уменьшается в 2,8 раза, эпителиоциты со слабоокрашенной цитоплазмой увеличиваются в 1,5 раза. В роговом слое многослойного плоского эпителия у пациентов с пародонтитом эпителиоциты с интенсивно окрашенной цитоплазмолй отсутствуют, количество умеренно окрашенных ― уменьшается в 1,6 раза, количество слабо окрашенных ― увеличивается в 2,8 раза (табл. 2).

 Таблица 2.

Интенсивность экспрессии Е-кадгерина в исследованных образцах эпителия десны пациентов исследуемой группы и группы сравнения

Слои многослойного плоского эпителия	Группа сравнения, n=20			Исследуемая группа, n=21
	Интенсивное окраши-вание, %	Умеренное окраши-вание, %	Слабо окраши-вание, %	Интенсивное окраши-вание, %	Умеренное окраши-вание, %	Слабо окраши-вание, %
Базальный	16,0±0,18*	26,2±0,5	57,8±0,84	3,75±0,18	10,75±0,16**	66,8±0,93
Шиповатый	17,3±1,5*	29,2±0,75	51,5±0,7	7,9±0,15	16,5±0,2**	65,2±0,7
Зернистый	18,5±0,7	13,75±0,2	62,8±1,0	—	5,0±0,7	95,0±0,2
Роговой	25,0±0,45	19,0±0,62	36,6±0,9	—	1,2±0,3	99,8±0,4

Примечание: * ― p<0,01, ** ― p<0,05

В многослойном эпителии десны p-53-позитивные клетки располагались в базальном и шиповатом слоях (рис. 2А). В группе сравнения процент p-53 положительно окрашенных эпителиоцитов составил 25,3±0,34 (рис. 2А, рис. 3). При пародонтите процентное содержание положительно окрашенных клеток увеличилось до 27,2±0,64 (рис. 2Б, рис. 3).

 Рисунок 2.

Иммуногистохимический метод выявления p-53. Многослойный плоский эпителий десны. Группа сравнения (А), группа с хроническим генерализованным пародонтитом (Б). 1 ― p-53 позитивные эпителиоциты. Микроскоп МИКМЕД-5. Об. 90

Рисунок 3.

Процент p-53 положительно окрашенных клеток в тканях межзубного сосочка десны у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом (ХГП) и в группе сравнения. Многослойный плоский эпителий (А)

Обсуждение результатов

По результатам проведенного исследования в биоптатах десны у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом увеличивается количество, длина и ширина соединительнотканных сосочков многослойного плоского эпителия. Данные показатели характеризуют активацию компенсаторных механизмов тканей десны при хроническом генерализованном пародонтите.

Экспресиия Е-кадгерина в межклеточном веществе и цитоплазме эпителиоцитов при хроническом генерализованном пародонтите уменьшается. Полученные данные указывают на снижение межклеточных адгезионных связей при хроническом воспалении. Клеточная адгезия — необходимое условие для поддержания взаимосвязи между клетками и сохранения структуры ткани [11, 7].

P-53-позитивные клетки выявляли в базальном и шиповатом слоях многослойного эпителия десны. Как известно, p-53 является важным участником апоптоза. Активность процессов апоптоза эпителиоцитов при воспалительно-деструктивных поражениях пародонта повышается [5].

 Заключение

При хроническом генерализованном пародонтите в многослойном плоском эпителии десны уменьшается количество межклеточных адгезионных связей, компенсаторно активизируются пролиферативные процессы. Данные сведения могут быть использованы для расширения диагностического этапа курации пациентов с воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта и обоснования применения фармакотерапевтических и физиотерапевтических методов лечения.

 ЛИТЕРАТУРА

1. Быков В.А. Функциональная морфология эпителиального барьера слизистой оболочки полости рта // Стоматология. — 2003. — №3. — С. 12-17.
2. Грудянов А.И., Дмитриева Л.А., Максимовский Ю.М. Пародонтология. Современное состояние вопроса и направление научных разработок // Стоматология. — 1999. — №1 — С. 16-21.
3. Максимовский Ю.М., Митронин А.В. Основные направления профилактики и лечения хронического воспаления в области периодонта // Российский стоматологический журнал. —2004. — №1. — С. 16-19.
4. Kaner D., Bemimoulin J.P., Kleber В.М., Friedmann A. Minimally invasive flap surgery and enamel matrix derivative in the treatment of localized aggressive periodontitis: case report // Int. J. Periodontics Restorative Dent. — 2009. — Vol. 29 (1). — P. 89-97.
5. Григорович Э.Ш., Городилов Р.В., Заблоцкая Е.А. Клеточное обновление эпителия десны у больных хроническим генерализованным пародонтитом под влиянием начального пародонтологического лечения // Институт Стоматологии. — 2011.— №2 (51). — С. 62-65.
6. Чумаков П.М. Белок p-53 и его универсальные функции в многоклеточном организме // Успехи биологической химии. — 2007. — Т. 47. — С. 3-52.
7. Короленкова Л.И., Степанова Е.В., Ермилова В.Д., Барышников А.Ю., Брюзгин В.В. Экспрессия е-кадгерина ― биохимический маркер прогрессии заболевания при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях // Вестник московского университета. Серия 2. Химия. — 2012. — Т. 53, №4. — С. 272-277.
8. Gall T.M., Frampton A.E. Gene of the mouth: E-cadherin (CDH1) // J. Clin. Pathol. — 2013 Nov. — Vol. 66 (11). — P. 928-32.
9. Москвичев Е.В. Морфофункциональные изменения аутотрансплантата селезенки в первые два месяца после операции: дис. … канд. мед. наук. — 2004. — 79 с.
10. Батюшин М.М., Пасечник Д.К. Выявление выментина, панцитокератина, гладкомшечного актина, Е-катгерина и антител к CD-10-маркеров эпителиально-мезенхимальной трансформации при хроническом гломерулонефрите // Нефрология. —2014. — Т. 18, №5. — С. 52-58.
11. Авдалян А.М., Климачев В.В., Бобров И.П., и др. Амплификация гена HER2/NEU при лейомиосаркоме тела матки: встречаемость, клинико-морфологические особенности, связь с прогнозом // Российский онкологический журнал. — 2015. — №4. — С. 18-19.

REFERENCES

1. Bykov V.A. Funktsionalnaya morfologiya epitelialnogo baryera slizistoy obolochki polosti rta. Stomatologiya, 2003, no. 3, pp. 12-17.
2. Grudyanov A.I., Dmitriyeva L.A., Maksimovskiy Yu.M. Parodontologiya. Sovremennoye sostoyaniye voprosa i napravleniye nauchnykh razrabotok. Stomatologiya, 1999, no. 1, pp. 16-21.
3. Maksimovskiy Yu.M., Mitronin A.V. Osnovnyye napravleniya profilaktiki i lecheniya khronicheskogo vospaleniya v oblasti periodontal. Rossiyskiy stomatologicheskiy zhurnal, 2004, no. 1, pp. 16-19.
4. Kaner D., Bemimoulin J.P., Kleber V.M., Friedmann A. Minimally invasive flap surgery and enamel matrix derivative in the treatment of localized aggressive periodontitis: case report. Int. J. Periodontics Restorative Dent, 2009, vol. 29 (1), pp. 89-97.
5. Grigorovich E.Sh., Gorodilov R.V., Zablotskaya E.A. Kletochnoye obnovleniye epiteliya desny u bolnykh khronicheskim generalizovannym parodontitom pod vliyaniyem nachalnogo parodontologicheskogo lecheniya, 2011, no. 2(51), pp. 62–65.
6. Chumakov P.M. Belok p-53 i ego universalnyye funktsii v mnogokletochnom organizme. Uspekhi biologicheskoy khimii, 2007, no. 47, pp. 3-52.
7. Korolenkova L.I., Stepanova E.V., Ermilova V.D., Baryshnikov A.Yu., Bryuzgin V.V. Ekspressiya e-kadgerina-biokhimicheskiy marker progressii zabolevaniya pri tservikalnykh intraepitelialnykh neoplaziyakh. Vestnik moskovskogo universiteta. Seriya 2. Khimiya, 2012. no. 4, pp. 272-277.
8. Gall T.M., Frampton A.E. Gene of the mouth: E-cadherin (CDH1). J Clin Pathol, 2013, Vol.66 (11), pp. 928-32.
9. Moskvichev E.V. Morfofunktsionalnyye izmeneniya autotransplantata selezenki v pervyye dva mesyatsa posle operatsii. dis…kand. med. nauk, 2004. 79 p.
10. Batyushin M.M., Pasechnik D.K. Vyyavleniye vymentina. pantsitokeratina. gladkomshechnogo aktina. E-katgerina i antitel k CD-10-markerov epitelialno-mezenkhimalnoy transformatsii pri khronicheskom glomerulonefrite. Nefrologiya, 2014, no. 5, pp. 52-58.
11. Avdalyan A.M., Klimachev V.V., Bobrov I.P., Lazarev A.F., Lushnikova E.L., Nepomnyashchikh L.M. Amplifikatsiya gena HER2/NEU pri leyomiosarkome tela matki: vstrechayemost. kliniko-morfologicheskiye osobennosti. svyaz s prognozom. Rossiyskiy onkologicheskiy zhurnal, 2015, no. 4., pp. 18-19.