УДК 617.713-002.6:579.882.11

 О.И. ЛЕБЕДЕВ¹, А.В. СУРОВ¹, Е.В. АКЕНТЬЕВА², М.М. САЛИХОВ³

¹Омский государственный медицинский университет, 644099, г. Омск, ул. Ленина, д. 12

²Клиническая офтальмологическая больница им. В.П. Выходцева, 644024, г. Омск, ул. Лермонтова, д. 60

³Исилькульская центральная районная больница, 646020, Омская область, г. Исилькуль, ул. Тельмана, д. 167 

Лебедев Олег Иванович ― доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой офтальмологии, тел. +7-968-107-55-55, e-mail: leo.55@mail.ru

Суров Александр Владимирович ― кандидат медицинских наук, доцент кафедры офтальмологии, тел. +7-906-197-93-16, e-mail: abc55.79@mail.ru

Акентьева Евгения Витальевна ― врач-офтальмолог, тел. +7-904-328-88-51, e-mail: evgenia.akenteva@mail.ru

Салихов Максим Маратович ― врач-офтальмолог, тел. +7-905-099-23-28, e-mail: max25111989@mail.ru

 С целью изучения информативности методов этиологической верификации хламидийных увеитов проведено комплексное клиническое обследование 30 пациентов с первичным эпизодом или рецидивами воспалительных заболеваний сосудистой оболочки глаз с подозрением на хламидийную природу заболевания. Верификация диагноза проводилась на базе Академического центра лабораторной диагностики г. Омска с применением следующих методов: метода иммуноблотинга с исследованием слезной жидкости набором RecomLine Chlamidia IgА/IgG (иммуноглобулинов А/иммуноглобулинов G) и тест-системы Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости. Хламидийная этиология заболевания подтвердилась у 4 пациентов. Примененные методы лабораторной диагностики: recomLine Chlamydia IgA/IgG (иммуноблот) и тест-система Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA впервые были использованы с целью исследования слезной жидкости на обнаружение Chlamydia trachomatis с определением маркера острой фазы инфекционного процесса (IgA). Полученные результаты в сравнении с традиционными методами диагностики сыворотки крови (метод ИФА с определением IgМ/IgG к Chlamydia trachomatis) позволяют заключить о большей информативности исследуемых методов в диагностике офтальмохламидиоза с поражением сосудистого тракта глаза.

Ключевые слова: этиологическая верификация, увеиты, иммуноблот, слезная жидкость.

 

O.I. LEBEDEV¹, A.V. SUROV¹, E.V. AKENTYEVA², M.M. SALIKHOV³

¹Omsk State Medical University, 12 Lenin Str., Omsk, Russian Federation, 644099

²Clinical Ophthalmologic Hospital named after V.P. Vykhodtsev, 60 Lermontov Str., Omsk, Russian Federation, 644024

³Isilkul Central Regional Hospital, 167 Telman Str., Isilkul, Omsk region, Russian Federation, 646020

 New opportunities of chlamydial etiology verification in patients with idiopathic uveites

 Lebedev O.I. — D. Med. Sc., Professor, Head of Ophthalmology Department, tel. +7-968-107-55-55, e-mail: leo.55@mail.ru

Surov A.V. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of Ophthalmology Department, tel. +7-906-197-93-16, e-mail: abc55.79@mail.ru

Akentyeva E.V. — ophthalmologist, tel. +7-904-328-88-51, e-mail: evgenia.akenteva@mail.ru

Salikhov M.M. — ophthalmologist, tel. +7-905-099-23-28, e-mail: max25111989@mail.ru

The research objective was to assess the methods of etiological verification of chlamydial uveites. 30 patients were examined, with the primary episode or relapse of inflammatory diseases of choroid of suspected chlamydial origin. The diagnosis was verified in the Omsk Academic Center of Laboratory Diagnostics. The following methods were applied: immunoblotting of plaintive liquid with the RecomLine Chlamidia IgA/IgG set (immunoglobulins A/immunoglobulins G) and Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA test system with research of plaintive liquid was used. The chlamydial etiology of a disease was confirmed in 4 patients. The applied laboratory diagnostic methods: immunoblotting of plaintive liquid with the recomLine Chlamydia IgA/IgG and Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA set were used for the first time for the research of plaintive liquid to diagnose the Chlamydia trachomatis and the marker of acute phase of infectious process (IgA). The obtained results compared to the traditional methods of diagnosing the blood serum (determining the IgМ/IgG to Chlamydia trachomatis) proved to be more informative for diagnosing the chlamydial eye infection with lesions of the eye vascular tract.

Key words: etiological verification, uveites, immunoblot, plaintive liquid.

 

Значимость проблемы увеитов определяется не столько распространенностью заболевания, сколько тяжестью и рецидивирующим характером течения, его высоким инвалидизирующим эффектом, а также преимущественным поражением лиц молодого и трудоспособного возраста [1-3]. Неуклонно растет количество больных с увеитами хламидийной этиологии, что связано с урбанизацией и изменением в половом поведении населения [1, 4]. Все вышесказанное диктует необходимость поиска и внедрения в практическую деятельность новых методов диагностики с целью повышения качества лабораторной верификации хламидийной инфекции.

Отсутствие единого подхода к диагностике гематогеннных форм офтальмохламидиоза объясняется недостаточным знанием патогенетических механизмов развития воспалительного процесса хламидийной этиологии, связанного с гематогенной диссеминацией [5]. Фагоцитоз при хламидийной инфекции является незавершенным, сопровождается крайне неблагоприятной разновидностью внутриклеточного паразитирования, развитием микроорганизмов в цитоплазме клеток очагов поражения, что приводит к гибели фагоцитов [6]. Сложные комплексы микробов, образованные вследствие накопления лейкоцитов с незавершенным фагоцитозом, диссеминируют по сосудистому руслу, формируя новые очаги инфекции [7]. Предрасполагающими факторами для метастатического поражения сосудистой оболочки служит выраженная разветвленность кровеносных сосудов и замедленный кровоток в области увеального тракта, способствующие задержке здесь патогенных агентов [7, 8].

Исследование иммунного статуса слезной жидкости при воспалительной офтальмопатологии является перспективным и в то же время малоизученным направлением для прогнозирования течения заболевания и оценки проведенного лечения. [9]. Общеизвестно, что внедрение в макроорганизм хламидийной инфекции активирует индукцию секреторного IgA, цитотоксическое действие T-клеток и гуморальный ответ путем выработки специфических к возбудителю антител класса IgA, IgG, IgМ [6]. Однако длительная персистирующая, хроническая хламидийная инфекция, частые рецидивы заболевания приводят к комбинированному иммунодефициту: снижению активности клеточного и гуморального иммунитета с тенденцией к снижению общего количества T- и В-лимфоцитов [6].

Пониманию специфического иммунопатологического механизма развития воспалительных заболеваний сосудистого тракта и их осложнений, своевременной диагностике и патогенетически ориентированной терапии может способствовать комплексное изучение факторов иммунологической реактивности слезной жидкости [10-12]. В связи с этим появление на рынке тест-систем иммуноблотинга с набором RecomLine Chlamidia IgА/IgG значительно расширило возможности верификации хламидийной инфекции.

 Цель исследования ― провести оценку информативности методов иммуноблотинга слезной жидкости с набором Recom Line Chlamidia IgА/ IgG и тест-системы Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости в сравнении с методом иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови антител к Chlamydia trachomatis (IgМ, IgG) в качестве методов верификации хламидийных поражений сосудистой оболочки глаз.

 Материал и методы

Исследование проведено на базе БУЗОО «Клиническая офтальмологическая больница имени В.П. Выходцева», кафедры офтальмологии ФГБОУ ВО ОмГМУ Минздрава России, Академического центра лабораторной диагностики г. Омска. Всего обследовано 30 человек, средний возраст которых составил 34±7,8 лет. Критерием включения являлось наличие у пациентов воспалительных заболеваний переднего и заднего отдела сосудистой оболочки глаза предположительно хламидийной этиологии.

Первый этап обследование включал: биомикроскопию переднего отрезка глаза, офтальмоскопию, общие анализы крови и мочи, реакцию Райта ― Хеддельсона на бруцеллез, ревмотесты, диагностику инфекционных агентов методом иммуноферментного анализа (ИФА) сыворотки крови (определение антител к токсоплазменным антигенам (A-TOXO IgA, IgG), антител к вирусу простого герпеса IgМ, IgG, антител к капсидному антигену IgМ, IgG вируса Эпштейн ― Барра, антител к раннему антигену вируса Эпштейн ― Барра, антител к ядерному антигену вируса Эпштейн ― Барра, антител к Chlamydia trachomatis (IgМ, IgG). Для исключения сопутствующей патологии пациентам были назначены консультации смежных специалистов (оториноларинголога, стоматолога, фтизиатра, ревматолога).

На втором этапе материалом для исследования являлась слезная жидкость пациентов, забор которой производился из конъюнктивальной полости. Слезотечение стимулировали 10% нашатырным спиртом. Слезу при помощи микрокапилляра собирали в колбу Эппендорфа. Слезотечение стимулировали нашатырным спиртом. Образцы материалов были доставлены в Академический центр лабораторной диагностики г. Омска. У 15 пациентов исследование слезной жидкости проводили методом иммуноблота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG, предназначенного для качественного определения человеческих IgA/IgG-антител к Chlamydia trachomatis. Тестовый стрип с нанесенным на его поверхности экстрактом антигенов Chlamidia trachomatis помещали в лунку инкубационного лотка с буферным раствором, затем добавляли 20 микролитров слезной жидкости пациента. Следующим этапом проводили инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре с мягким встряхиванием. Разведенную сыворотку аспирировали из индивидуальных лунок, промывали готовый к использованию буфер 3 раза на шейкере, после чего добавляли 2 миллилитра, приготовленного конъюгата и снова инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре при мягком встряхивании. Затем проводился цикл трехкратного промывания на шейкере и инкубация стрипа в течение 5-10 минут. После промывали стрипы деионизованной водой, высушивали между двумя слоями фильтровальной бумаги в течение 2 часов. Идентификацию стрипов осуществляли на основании сравнения с контрольным тест-стрипом (см. рис.).

Рисунок.

Результаты оценки стрипов методом иммуноблотинга слезной жидкости с набором RecomLine Chlamidia иммуноглобулинов А и G

Также у 15 пациентов для диагностики хламидийной инфекции была использована тест-система Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости. В тест-системе Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA используется метод непрямого тревдофазного иммуноферментного анализа (ИФА)

 Результаты и обсуждение

При исследовании сыворотки крови методом у 100% пациентов IgM к Chlamydia trachomatis не были обнаружены. Ограниченная информативность метода объясняется рядом причин. IgM антитела в сыворотке пациентов являются ранним маркером инфекции, появляются первыми при иммунологическом ответе макроорганизма, инфицированного хламидиями. Основное количество IgM сосредоточено в сосудистом русле [12]. Период полураспада составляет 5 дней. Пик IgM приходится на 1-2-ю неделю. Затем происходит снижение титра антител. Как правило, IgM полностью исчезают через 1-2 месяца независимо от проведенного лечения. Эти антитела присутствуют только при острой фазе заболевания и не определяются при реинфекции [13]. Антитела данного класса в ряде случаев могут не выявляться у подростков и взрослых при острой реинфекции (предыдущее инфицирование Chlamydia trachomatis или другими видами хламидий (Chlamydia pneumonia)) [4].

У всех пациентов отмечаются средние титры IgG к Chlamydia trachomatis (1:16 — 1:32). Полученные результаты малоинформативны. Величина титра не всегда свидетельствует об интенсивности воспалительного процесса или о стадии заболевания [14]. Этиология воспаления на первом этапе обследования не была установлена.

Следует отметить, что в последнее время достигнут значительный прогресс в разработке и применении современных лабораторных технологий диагностики различных оппортунистических инфекций: развитие серологических тестов, главным образом, иммуноферментного анализа с исследованием сыворотки крови, где определяют титры антител IgG (маркер хронической фазы инфекционного процесса) и антител IgМ (маркер острой фазы инфекционного процесса) с определением индекса авидности, появление метода иммуноблота с исследованием сыворотки крови и слезной жидкости [15, 16]. Учитывая возможность выявления методом иммуноблота разноспецифичных антигенов (белков), формируемых в разных фазах инфекционного процесса, можно на данном этапе в каждом конкретном случае установить степень активности, давность инфекции и провести клинико-лабораторные параллели между инфекцией и воспалением глаза [17-19]. Диагностическая значимость данного метода особенно повышается при увеитах и их рецидивирующих формах, когда методом ИФА с исследованием сыворотки крови и исследованием соскобов (РИФ, ПЦР) исключить или подтвердить активность инфекции невозможно [17-19].

На втором этапе при исследовании методом иммуноблота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG у 2 пациентов, стандартное исследование которых оказалось неинформативным, в слезной жидкости обнаружено наличие IgA Chlamidia trachomatis.

В результате исследования слезной жидкости с использованием тест-системы Immuno Comb Chlamydia trachomatis IgA у трех пациентов подтвердилась хламидийная этиология увеитов

 Выводы

1. Определение IgM в сыворотки крови методом ИФА к Chlamydia trachomatis в практическом здравоохранении имеет ограниченное значение, из-за невысоких уровней и короткого времени выработки антихламидийных антител класса M [13]. Определение уровня антител IgG к хламидиям в крови необходимо проводить в динамике, оценка результатов исследований, основанная на однократном анализе, ненадежна [13].

2 Определение антител к Chlamydia trachomatis в крови методом ИФА является вспомогательным тестом для диагностики хламидиоза, так как из-за низкой иммуногенности у 50% больных хламидиозом антитела не обнаруживают [8].

3. Впервые примененные нами методы иммуноблота слезной жидкости набора recomLine Chlamydia IgA/IgG и ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgA с исследованием слезной жидкости с целью диагностики офтальмохламидиоза оказались информативным при воспалительных заболеваниях переднего и заднего отдела сосудистой оболочки глаза. Хламидийная этиология заболевания подтвердилась у 13% пациентов. Таким образом, использование данных методов этиологической верификации способствует ранней диагностике офтальмохламидиоза и проведению своевременной этиотропной и иммуномодулирующей терапии.

 ЛИТЕРАТУРА

1. Бейшенова Г.А. Исследования эффективности антиоксидантной терапии при увеите (экспериментальное исследование): автореф. дис. … канд. мед. наук: 14.01.07, 03.01.04 / Г.А. Бейшенова. ― М., 2015. ― C. 3.
2. Wensing B., Relvas L.M., Caspers L.E., et al. Comparison of rubella virus and herpes virus-associated anterior uveitis // Ophthalmology. ― 2011. ― 118 (10). ― P. 1905-1910.
3. Kongyai N., Sirirungsi W., Pathanapitoon K., et al. Viral causes of unexplained anterior uveitis in Thailand // Eye (Lond). ― 2012. ― 26 (4). ― P. 529-534.
4. Хворик Д.Ф., Цыркунов В.М., Конкин Д.Е. Оценка иммунного ответа при экспериментальном хламидиозе // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. ― 2008. ― №3 (23). ― С. 80.
5. Воробьева М.С., Манзенюк И.Н. Chlamidia trachomatis: современные представления о возбудителе. Серодиагностика // Науч.-метод. пособие. ― Новосибирск. ― 2001. ― 29 с.ентальном хламидиозе // Журнал ГрГМУ. ― 2008. ― Т. 23, №7. ― С. 80.
6. Земсков А.М., Гертнер Л.В. Клинико-иммунологические нарушения у пациентов с различными формами хламидийной инфекции // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». ― 2011. ― №1. ― С. 36-37.
7. Ченцова О.Б., Межевова И.Ю., Качков И.А. Этиология, патогенез, клинические формы, диагностика и лечение офтальмохламидиоза (обзор литературы) // РМЖ «Клиническая Офтальмология». ― 2004. ― №1. ― С. 35.
8. Jabs D.A., Rosenbaum J.T., Foster C.S. et al. Guidelines for the use of immunosuppressive drugs in patients with ocular inlammatory disorders: recommendations of an expert panel // Am. J. Ophthalmol. ― 2000. ― 130 (4). ― P. 492-513.
9. Лебедев О.И, Суров А.В., Акентьева Е.В., Именнова Н.Г. Эволюция возможностей диагностики воспалительных заболеваний сосудистого тракта глаза на примере субъекта Федерации // Российский офтальмологический журнал. ― 2016. ― №4. ― С. 22-28.
10. Smith J.A., Mackensen F., Sen H.N. et al. Epidemiology and course of disease in childhood uveitis // Ophthalmology. ― 2009. ― 116 (8). ― P. 1544-1551.
11. Kenneth G.-J. Ooi, Galatowicz G., Calder V.L., Lightman S.L. Cytokines and Chemokines in Uveitis ― Is there a Correlation with Clinical Phenotype? // Clinical Medicine & Research. ― 2006. ― Vol. 4, №4. ― P. 294-309.
12. Волкович Т.К. Защитные факторы слезной жидкости и их значение в диагностике заболеваний глаз // Вестник Витебского государственного медицинского университета. ― 2008. ― Т. 7, №3. ― С. 104-109.
13. Межевова И.Ю., Ченцова О.Б. Эффективность иммунодиагностики и иммуномодулирующего лечения при офтальмохламидиозе // Альманах клинической медицины. ― М., 2010. ― №22. ― С. 17-20.
14. Лебедев О.И., Суров А.В., Молчанова Е.В. Показатели цитокинового профиля у пациентов с увеитами при оппортунистических инфекциях // Офтальмологические ведомости. ― 2010. ― 3 (4). ― С. 32-36.
15. Суров А.В., Лебедев О.И., Молчанова Е.В. Иммунологические показатели у пациентов с увеитами и их рецидивирующими формами на фоне оппортунистических инфекций // Российский офтальмологический журнал. ― 2011. ― Т. 4, №2. ― С. 56-59.
16. Geisler W.M., Morrison S.G., Doemland M.L., et al. Immunoglobulin-Specific Responses to Chlamydia Elementary Bodies in Individuals with and at Risk for Genital Chlamydial Infection // Journal of Infectious Diseases Advance. ― 2014. ― 7 (2). ― P. 13-17.
17. Лебедев О.И., Суров А.В., Акентьева Е.В. Особенности верификации воспалительных заболеваний глаз (на примере субъекта федерации) // Офтальмологические ведомости.
18. Лебедев О.И., Суров А.В., Матненко Т.Ю., Салихов М.М. Иммунотерапия увеитов, ассоциированных с системными заболеваниями // Русский медицинский журнал. ― 2013. ― 2. ― С. 69-71.
19. Ченцова О.Б., Межевова И.Ю., Качков И.А. Метод специфической диагностики гематогенных форм офтальмохламидиоза // РМЖ «Клиническая Офтальмология». ― 2007. ― №2. ― С. 52.

REFERENCES

1. Beyshenova G.A. Issledovaniya effektivnosti antioksidantnoy terapii pri uveite (eksperimental’noe issledovanie): avtoref. dis. … kand. med. nauk [Studies of the effectiveness of antioxidant therapy in uveitis (experimental study). Synopsis of dis. PhD med. sciences]. Moscow, 2015. P. 3.
2. Wensing B., Relvas L.M., Caspers L.E., et al. Comparison of rubella virus and herpes virus-associated anterior uveitis. Ophthalmology, 2011, 118 (10), pp. 1905-1910.
3. Kongyai N., Sirirungsi W., Pathanapitoon K., et al. Viral causes of unexplained anterior uveitis in Thailand. Eye (Lond), 2012, 26 (4), pp. 529-534.
4. Khvorik D.F., Tsyrkunov V.M., Konkin D.EEvaluation of the immune response in experimental chlamydiosis. Zhurnal Grodnenskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta, 2008, no. 3 (23), p. 80 (in Russ.).
5. Vorob’eva M.S., Manzenyuk I.N. Chlamidia trachomatis: sovremennye predstavleniya o vozbuditele. Serodiagnostika. Nauch.-metod. Posobie [Chlamidia trachomatis: modern ideas about the pathogen. Serodiagnostics. Scientific-method. Allowance]. Novosibirsk, 2001. 29 p. ental’nom khlamidioze. Zhurnal GrGMU, 2008, vol. 23, no.7, p. 80 (in Russ.).

6. Zemskov A.M., Gertner L.V. Clinical and immunological disorders in patients with various forms of chlamydial infection. Kurskiy nauchno-prakticheskiy vestnik “Chelovek i ego zdorov’e”, 2011, no. 1, pp. 36-37 (in Russ.).
7. Chentsova O.B., Mezhevova I.Yu., Kachkov I.A. Etiology, pathogenesis, clinical forms, diagnosis and treatment of ophthalmoccidiosis (literature review). RMZh “Klinicheskaya Oftal’mologiya”, 2004, no. 1, p. 35 (in Russ.).
8. Jabs D.A., Rosenbaum J.T., Foster C.S. et al. Guidelines for the use of immunosuppressive drugs in patients with ocular inlammatory disorders: recommendations of an expert panel. Am. J. Ophthalmol, 2000, 130 (4), pp. 492-513.
9. Lebedev O.I, Surov A.V., Akent’eva E.V., Imennova N.G. Evolution of the possibilities of diagnosing inflammatory diseases of the vascular tract of the eye using the example of a subject of the Federation. Rossiyskiy oftal’mologicheskiy zhurnal, 2016, no. 4, pp. 22-28 (in Russ.).
10. Smith J.A., Mackensen F., Sen H.N. et al. Epidemiology and course of disease in childhood uveitis. Ophthalmology, 2009, 116 (8), pp. 1544-1551.
11. Kenneth G.-J. Ooi, Galatowicz G., Calder V.L., Lightman S.L. Cytokines and Chemokines in Uveitis ― Is there a Correlation with Clinical Phenotype? Clinical Medicine & Research, 2006, vol. 4, no. 4, pp. 294-309.
12. Volkovich T.K. Protective factors of tear fluid and their significance in the diagnosis of eye diseases. Vestnik Vitebskogo gosudarstvennogo meditsinskogo universiteta, 2008, vol. 7, no. 3, pp. 104-109 (in Russ.).
13. Mezhevova I.Yu., Chentsova O.B. Efficiency of immunodiagnostics and immunomodulatory treatment in ophthalmoccidiosis. Al’manakh klinicheskoy meditsiny, 2010, no. 22, pp. 17-20 (in Russ.).
14. Lebedev O.I., Surov A.V., Molchanova E.V. Cytokine profile in patients with uveitis in opportunistic infections. Oftal’mologicheskie vedomosti, 2010, 3 (4), pp. 32-36 (in Russ.).
15. Surov A.V., Lebedev O.I., Molchanova E.V. Immunological indicators in patients with uveitis and their relapsing forms against the backdrop of opportunistic infections. Rossiyskiy oftal’mologicheskiy zhurnal, 2011, vol. 4, no. 2, pp. 56-59 (in Russ.).
16. Geisler W.M., Morrison S.G., Doemland M.L., et al. Immunoglobulin-Specific Responses to Chlamydia Elementary Bodies in Individuals with and at Risk for Genital Chlamydial Infection. Journal of Infectious Diseases Advance, 2014, 7 (2), pp. 13-17.
17. Lebedev O.I., Surov A.V., Akent’eva E.V. Features of verification of inflammatory eye diseases (on the example of a subject of the federation). Oftal’mologicheskie vedomosti (in Russ.).
18. Lebedev O.I., Surov A.V., Matnenko T.Yu., Salikhov M.M. Immunotherapy of uveitis associated with systemic diseases. Russkiy meditsinskiy zhurnal, 2013, 2, pp. 69-71 (in Russ.).
19. Chentsova O.B., Mezhevova I.Yu., Kachkov I.A. The method of specific diagnostics of hematogenic forms of ophthalmoccidiosis. RMZh “Klinicheskaya Oftal’mologiya”, 2007, no. 2, pp. 52 (in Russ.).