УДК 613.952

Е.В. ПОДСВИРОВА¹, М.М. ГУРОВА^1,2,3, Т.А. РОМАНОВА¹

¹ Белгородский государственный национальный исследовательский университет Минобрнауки РФ, г. Белгород

²Санкт-Петербургский государственный педиатрический университет МЗ РФ, г. Санкт-Петербург

³ Клинико-диагностический центр для детей, г. Санкт-Петербург

Контактная информация:

Подсвирова Елена Васильевна ― ассистент кафедры педиатрии с курсом детских хирургических болезней

Адрес: 308015,  г. Белгород, ул. Победы, д. 85, тел. +7-910-323-80-83, e-mail: itely@mail.ru

 Цель работы. Изучить уровень показателей фекальных биомаркеров (эозинофильного нейротоксина и фекального кальпротектина) у новорожденных детей в зависимости от назначения беременным женщинам пробиотического препарата в течение 6 недель перед родами.

Материал и методы. Были сформированы 2 группы: основная (n = 63), в которой назначался пробиотический препарат, содержащий Bifidobacteriumlongum и Streptococcusthermophilus в количестве 10⁷ и группа сравнения (n = 52), не получавшая пробиотик. После рождения у детей оценивался уровень фекальных биомаркеров на 3-4 и 27-28 день после рождения.

Результаты. Было показано, что уровни фекальных биомаркеров у детей в первые дни жизни были выше, чем в 27-28 дней жизни, независимо от назначения пробиотика матерям перед родами, в тоже время у детей матерей основной группы оба показателя были значимо ниже, чем в группе сравнения.

Выводы. У детей матерей основной группы уровень фекальных биомаркеров воспаления был значимо ниже, чем у детей группы сравнения. При последующем наблюдении за детьми в течение первого года жизни, показано, что у детей основной группы достоверно реже выявлялись функциональные заболевания желудочно-кишечного тракта (4,8 против 32,6%, р = 0,034) и проявления пищевой аллергии (7,9 против 30,8%, р = 0,012).

Ключевые слова: новорожденные, неинвазивные фекальные биомаркеры, фекальный кальпротектин, эозинофильный нейротоксин, пробиотики, беременные женщины.

 

E.V. PODSVIROVA¹, M.M. GUROVA^1,2,3, T.A. ROMANOVA¹

¹Belgorod State National Research University of the Russian Ministry of Education, Belgorod

²Saint Petersburg State Pediatric University, Saint Petersburg

³Clinical Diagnostic Center for Children, Saint Petersburg

Non-invasive fecal biomarkers in newborns whose mothers received probiotics during 6 weeks before delivery

 Contact:

Podsvirova E.V. ― Assistant Lecturer of the Department of Pediatrics with a course of Surgical Diseases

Address: 85 Pobedy Str., 308015, Belgorod, Russian Federation, tel. +7-910-323-80-83, e-mail: itely@mail.ru

 Objective: to study the level of fecal biomarkers (eosinophilic neurotoxin and fecal calprotectin) in newborns depending on prescription of probiotics to pregnant women during 6 weeks before delivery.

Material and methods: 2 groups were formed: main group (n=63), which received probiotic containing 10⁷ Bifidobacteriumlongum and Streptococcusthermophilus, and comparison group (n=52), which did not receive a probiotic. After childbirth, the level of fecal biomarkers in children was estimated on the 3-4 and 27-28 day of life.

Results: It was shown that the levels of fecal biomarkers in children of the first days of life was higher than on the 27-28 day of life, regardless of the probiotic taken by mothers before delivery, but in children of the main group both indicators were significantly lower than in the comparison group.

Conclusion: In children of the main group, the levels of fecal inflammation biomarkers was significantly lower than in children of the comparison group. Further observation of children during the first year of life showed that the children of the main group had significantly less rate of functional diseases of gastrointesntinal tract (4.8% against 32.6%, р = 0.034) and manifestations of food allergy (7.9% against 30.8%, р = 0.012).

Key words: newborns, non-invasive fecal biomarkers, fecal calprotectin, eosinophilic neurotoxin, probiotics, pregnant women.

 

В 2001 году рабочая группа Национальных институтов здравоохранения стандартизировала определение понятия биомаркер как показатель, объективно измеряющий и оценивающий состояние нормальных биологических или патологических процессов в организме, и/или фармакологических реакций на то или иное терапевтическое вмешательство [1]. Биомаркер должен быть точным, воспроизводимым, удобным для пациента (предпочтительно неивазивным), легко интерпретируемым для клинициста, чувствительным и специфичным в отношении ожидаемого результата [2]. Биомаркеры используются при изучении особенностей нормального развития органов и систем в возрастном аспекте, в качестве средства оценки активности и тяжести течения заболевания и эффективности проводимой терапии. Особенно актуальна возможность их применения в периоде новорожденности, характеризующимся активными морфофункциональными перестройками органов и систем. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), подвергаясь процессам морфогенеза, проходит ряд критических этапов развития (формирование кишечного микробиома, становление иммунорегуляторных механизмов, продолжающееся структурно-функциональное развитие различных отделов, становление функционально-регулирующей оси нервная система ― ЖКТ), имеющих долгосрочные последствия для организма в целом [3]. На успешность прохождения данных этапов могут оказывать влияние различные факторы, к которым относится перинатальные факторы (состояние здоровья матери и особенности течения беременности), вид родовспоможения, характер вскармливания (естественное или искусственное) и формирование кишечной микробиоты [4]. В связи с особенностями постнатального развития ЖКТ, необходим диагностический инструмент (биомаркеры), который бы позволил выявлять отклонения от течения нормальных процессов и проводить своевременную коррекцию.

В качестве таких биомаркеров закономерный интерес вызывает возможность применения неинвазивных фекальных биомаркеров воспаления, к которым относятся фекальный кальпротектин (ФК) и эозинофильный нейротоксин (ЭНТ) ― группа гетерогенных белков, являющихся средством объективного измерения активности воспалительного процесса в слизистой оболочке (СО) кишечника [1, 5]. Кальпротектин служит индикатором миграции нейтрофилов в просвет кишечной трубки, секретируется стимулированными нейтрофилами, моноцитами или высвобождается при их разрушении или гибели, в связи с чем повышение уровня кальпротектина в фекалиях признано надежным маркером воспалительной активности в ЖКТ, эффективно применяется у детей с 4 лет и взрослых для дифференциальной диагностики воспалительных и функциональных заболеваний кишечника [6]. Эозинофильный нейротоксин (ЭНТ) ― белок, содержащийся в эозинофилах, обладает противопаразитарной, цитотоксической и противовирусной активностью. Повышение уровня эозинофильного нейротоксина показано при не-IgE-опосредованной аллергии к белкам коровьего молока у детей младшего возраста [5, 7], в меньшей степени ― при воспалительных заболеваниях кишечника. Однако эффективность их применения в периоде новорожденности остается спорной из-за исходно более высокого уровня показателя, превышающих более чем в 5 раз уровень взрослых и детей старше 4 лет.

Цель исследования ― изучить показатели неинвазивных фекальных биомаркеров (фекального кальпротектина и эозинофильного нейротоксина) у новорожденных детей, матери которых получали пробиотик в течение 6 недель перед родами.

Материал и методы. В исследование были включены беременные женщины (n=115) c физиологически протекавшей беременностью, которые в зависимости от преморбидного фона (на основании данных обменной карты по форме № 113/у) были распределены на 2 группы. В первую группу (основная) вошли женщины, имеющие в анамнезе 2 и более хронических заболевания, в том числе, мочеполовой сферы ― 63/54,8%. Во вторую подгруппу вошли беременные женщины без хронических заболеваний в анамнезе или имеющие 1 хроническое заболевание за исключением патологии мочеполовой сферы ― 52/46,2%. Женщины обеих групп были сопоставимы по возрасту, в среднем 28 лет. Критерии включения в исследование: 1) все беременные женщины с физиологическим течением беременности; 2) наличие добровольного информированного согласия на обработку полученных данных; 3) наличие добровольного информированного согласия на определение фекальных биомаркеров у новорожденного ребенка, на обработку полученных данных при последующем наблюдении за ребенком в периоде новорожденности и на первом году жизни.

Критерии исключения: 1) патологические состояния, возникшие во время беременности и обострение хронических заболеваний; 2) предшествующий назначению прием пробиотических препаратов за последние 6 мес., 3) женщины, отказавшиеся дать добровольное информированное согласие на обработку полученных данных.

В исследование включались новорожденные дети, родившиеся в результате физиологических родов у матерей исследуемых групп. Критерии включения новорожденных в исследование были следующие: 1) доношенные новорожденные, родившиеся на сроке гестации не ранее 37 недели в результате физиологических родов; 2) полученное информированное согласие на обследование и обработку полученных данных в периоде новорожденности и при последующем обследовании в течение 1 года жизни.

Критерии исключения детей из исследования: 1) дети, родившиеся преждевременно, на сроке гестации менее 37 недель, 2) доношенные дети, рожденные в результате патологических родов, включая оперативное родовспоможение, 3) в случае отказа женщин на обработку данных, полученных при обследовании ребенка.

Беременным женщинам основной группы с учетом высокого риска инфицирования в родах с профилактической целью в течение 6 нед. перед родами был назначен пробиотик, содержащий Bifidobacteriumlongum и Streptococcusthermophilus в количестве 10⁷, по 1 капсуле 2 раза в день, после еды (согласно инструкции  по применению препарата), содержащий только штаммы, присутствующие  в составе естественной микрофлоры кишечника  здорового человека.

Определение фекальных биомаркеров проводилось новорожденным детям на 3-4 сутки и в конце первого месяца жизни (в возрасте 27-28 дней). Родители собирали образцы стула сразу после дефекации, чтобы избежать повышения уровня ФК и ЭНТ, вызванного всасыванием воды из памперса. ФК определялся в образцах стула методом ELISA с использованием реактивов Calprest, (Nycomed), единицы измерения ― мкг/г, ЭНТ определялся в образцах стула методом ELISA с использованием реактивов Immundiagnostik, Bensheim, единицы измерения нг/г. Кроме того, ретроспективно, оценивалась частота выявления на первом году жизни следующих патологических состояний: 1) функциональные нарушения ЖКТ (регургитация, колики, нарушения характера стула); 2) аллергические заболевания; 3) алиментарно-зависимые состояния (нарушения питания, анемия, рахит).

Статистический анализ осуществлялся с помощью статистического пакета SSPS 13.0 для Windows. Полученные в результате исследования данные проанализированы с определением средней арифметической (М) и стандартного отклонения (SD). Нормальность распределения оценивалась с применением критерия Шапиро-Уилка. Оценка статистической значимости различий для данных, имеющих нормальное распределение, проводилась с использованием t-критерия Стьюдента для независимых выборок, для сравнения качественных данных в двух группах рассчитывался доверительный интервал (ДИ) для отношения шансов (ОШ). Применялся корреляционный анализ попарно по методу Пирсона. Полученные результаты оценивались как статистически значимые при уровне вероятности р < 0,05.

Результаты и их обсуждение. При оценке состояния детей после рождения и в неонатальном периоде значимых различий получено не было. Оценка по шкале APGAR у детей обеих групп составила 8-9 баллов. Максимальная транзиторная потеря массы тела у детей группы сравнения была незначимо больше, чем у детей основной группы и составила 5,9%, по сравнению с 5,2% (р = 0,061).

Значения показателей фекального кальпротектина и эозинофильного нейротоксина представлены в таблице 1.

Таблица 1. Значения фекального кальпротектина и эозинофильного нейротоксина у новорожденных детей на 3-4 день и 27-28 день после родов

Table 1. Amounts of fecal calprotectin and eosinophilic neurotoxin in newborns on the 3-4 and 27-28 day of life

Значения показателей	Кальпротектин (мкг/г)		Эозинофильный нейротоксин (нг/г)
	1 группа, М(SD)	2 группа, М(SD)	1 группа, М(SD)	2 группа, М(SD)
3-4 день	241,3 (78,6)*	315,6 (101,2)	162,4 (58,2)*	224,1 (83,4)
27-28 день	159,4 (82,1)*	268,2 (93,6)	138,5 (43,8)*	196,7 (75,6)

*― р < 0,01

Было показано, что значения фекальных биомаркеров (ФК, ЭНТ) у детей в первые дни жизни был выше, чем в конце первого месяца жизни (27-28 день), независимо от назначения пробиотика матерям перед родами. В тоже время у детей, матери которых получали пробиотик за 6 нед. перед родами, оба показателя были значимо ниже, чем в группе сравнения. Была выявлена положительная статистически значимая корреляционная взаимосвязь между концентрациями ЭНТ и ФК (r = 0,51, р < 0,001) и отрицательная корреляционная взаимосвязь между фекальными биомаркерами и возрастом детей (r = -0,42 и r = -0,46 соответственно, р < 0,01).

Полученные нами значения фекальных биомаркеров были выше нормативных показателей для детей старше 4-х лет и взрослых и были сопоставимы с показателями, полученными другими исследователями [1, 5]. Согласно имеющимся данным, высокие значения фекальных биомаркеров отражают физиологический особенности состояния ЖКТ новорожденных, характеризующегося повышенной проницаемостью СО кишечника [8], приводящей к трансэпителиальной миграции нейтрофилов, аналогичной у взрослых пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника [9]. Начиная с 1 мес. проницаемость СО постепенно уменьшается (процесс «закрытия кишки»), что сопровождается снижением указанных биомаркеров [10]. По мнению ряда авторов, определенную роль в этом процессе может играть становление микробиома кишечника и его влияние на формирование кишечного эпителиального гомеостаза [11, 12].

Частота выявления патологических состояний у детей на первом году жизни представлена в таблице 2.

Таблица 2. Структура патологических состояний, выявленных на первом году жизни у детей 1 и 2 групп

Table 2. Structure of pathological states identified in children of groups 1 and 2 during the 1^st year of life

Структура патологии	Дети 1 группы, n=63 (%)	Дети 2 группы, n=52 (%)	ОШ, 95% ДИ ОШ	Р
Паратрофия	3 (4,8)	9 (17,3)	2,2 [2,4-2,8]	р=0,17
Запоры	3 (4,8)	17 (32,6)	1,3 [1,1-1,4]	р=0,022
Синдром регургитации у млпденцев	2 (3,2)	7 (13,5)	2,1 [1,9-2,4]	р=0,034
Аллергический дерматит	5 (7,9)	16 (30,8)	2,5 [2,4-2,7]	р=0,012
Рахит	5 (7,9)	13 (25)	1,2 [1,1-1,6]	р=0,051
Анемия	3 (4,8)	10 (30,8)	1,1 [1,0-1,5]	р=0,035

ОШ – отношение шансов; ДИ – доверительный интервал

ОШ – odds ration; ДИ – confidence interval

Таким образом, по нашим данным, у детей, матери которых получали профилактическое лечение пробиотиком перед родами, достоверно реже выявлялись функциональные нарушения со стороны ЖКТ (синдром регургитации, запоры) ― 4,8% против 32,6% (р < 0,05), аллергический дерматит как следствие пищевой аллергии к белку коровьего молока (7,9 против 30,8% — р < 0,05).

Выводы. У новорожденных детей нормальные показатели фекального кальпротектина и эозинофильного нейротоксина в 5-6 раз превышают аналогичные показатели детей старше 4 лет и взрослых, что обусловлено морфофункциональными особенностями слизистой оболочки кишечника и формированием кишечного микробиома. У здоровых доношенных детей, чьи матери получали пробиотик перед родами в течение 6 недель, показатели фекальных биомаркеров (кальпротектин и эозинофильный нейротоксин) при рождении и в динамике через 1 мес. были достоверно ниже, чем у детей, матери которых не принимали пробиотик перед родами. Показана положительная корреляционная взаимосвязь между уровнями фекального кальпротектина и эозинофильного нейротоксина и отрицательная корреляция между фекальными биомаркерами и возрастом ребенка. Показано, что дополнительное применение пробиотиков у матерей с хроническими заболеваниями в течение 6 недель перед родами способствует улучшению состояния здоровья детей на 1 году жизни. Необходимы дальнейшие исследования для определения референтных показателей кишечных биомаркеров для новорожденных детей и детей первого года жизни.

Подсвирова Е.В. http://orcid.org/0000-0001-8642-6085

Гурова М.М. http://orcid.org/0000-0002-2666-4759

Романова Т.А.  http://orcid.org/0000-0003-3914-9139

ЛИТЕРАТУРА

1. Kapel N., Campeotto F., Kalach N., Baldassare M., Butel M.J., Dupont C. Faecalcalprotectin in term and preterm neonates // JPGN. ― 2010. ― Vol. 51, №5. ― P. 542-547.
2. Vasan R.S. Biomarkers of cardiovascular disease: molecular basis and practical considerations // Circulation. ― 2006. ― №113. ― Р. 2335-2362.
3. Гурова М.М., Новикова В.П. Эволюционные аспекты неонатальной гастроэнтерологии (часть 1) // Вопросы детской диетологии. ― 2017. ― Т.15, №4. ― С. 37-44.
4. Mulder I.E., Schmidt B., Stokes C.R., Lewis M., Bailey M., Aminov R.I., Prosser J.I., Gill B.P., Pluske J.R., Mayer C.D., Musk C.C., Kelly D. Environmentally-acquired bacteria influence microbial diversity and natural innate immune responses at gut surfaces // BMC Biol. ― 2009. ― Vol. 7. ― 79.
5. Roca M., Varela A.R., Donat E., Cano F., Hervas D., Armisen A., Vaya M.J., Sjolander A., Ribes-Koninckx C. Fecal calprotectin and eosinophil-derived neurotoxin in healthy children between 0 and 12 years // JPGN. ― 2017. ― Vol. 65, №4. ― Р. 394-398.
6. Dale I., Fagerhol M.K., Naesgaard I. Purification and partial characterization of highly immunogenic human leukocyte protein, the L1 antigen // Eur J Biochem. ― 1983. ― №134. ― Р.1-6.
7. Kalach N., Kapel N., Waligora-Dupriet A.J., et al. Intestinal permeability and fecal eosinophil-derived neurotoxin are the best diagnosis tools for digestive non-IgE-mediated cow’s milk allergy in toddlers // ClinChem Lab Med. ― 2013. ― №51. ― Р. 351-361.
8. Walker W.A. Gastrointestinal host defense: importance of gut closure in control of macromolecular transport // Ciba Found Symp. ― 1979. ― Р. 201-219.
9. Berstad A., Arslan G., Folvik G. Relationship between intestinal permeability and calprotectin concentration in gut lavage fluid // Scand J Gastroenterol. ― 2000. ― №35. ― Р. 64-69.
10. Rugtveit J., Fagerhol M.K. Age-dependent variations in fecal calprotectin concentrations in children // J Pediatr Gastoenterol Nutr. ― 2002. ― №34. ― Р. 323-325.
11. Baldassarre M.E., Altomare M.A., Fanelli M. et al. Does calprotectin represent a regulatory factor in host defense or a drug target in inflammatory disease? // Endocr, MetabImmunDisord Drug Targets. ― ― №7. ― Р.1-5.
12. Josefsson S., Bunn S.K., DomelloF.M. Fecal calprotectin invery low birth weight infants // J PediatrGastroenterolNutr. ― 2007. ― №44. ― Р.407-413.

REFERENCES

1. Kapel N., Campeotto F., Kalach N., Baldassare M., Butel M.J., Dupont C. Faecalcalprotectin in term and preterm neonates. JPGN, 2010, vol. 51, no. 5, pp. 542-547.
2. Vasan R.S. Biomarkers of cardiovascular disease: molecular basis and practical considerations. Circulation, 2006, no. 113, rr. 2335-2362.
3. Gurova M.M., Novikova V.P. Evolutionary aspects of neonatal gastroenterology (part 1). Voprosy detskoy dietologii, 2017, vol. 15, no. 4, pp. 37-44 (in Russ.).
4. Mulder I.E., Schmidt B., Stokes C.R., Lewis M., Bailey M., Aminov R.I., Prosser J.I., Gill B.P., Pluske J.R., Mayer C.D., Musk C.C., Kelly D. Environmentally-acquired bacteria influence microbial diversity and natural innate immune responses at gut surfaces. BMC Biol, 2009, vol. 7, p. 79.
5. Roca M., Varela A.R., Donat E., Cano F., Hervas D., Armisen A., Vaya M.J., Sjolander A., Ribes-Koninckx C. Fecal calprotectin and eosinophil-derived neurotoxin in healthy children between 0 and 12 years. JPGN, 2017, vol. 65, no. 4, rr. 394-398.
6. Dale I., Fagerhol M.K., Naesgaard I. Purification and partial characterization of highly immunogenic human leukocyte protein, the L1 antigen. Eur J Biochem, 1983, no. 134, rr.1-6.
7. Kalach N., Kapel N., Waligora-Dupriet A.J., et al. Intestinal permeability and fecal eosinophil-derived neurotoxin are the best diagnosis tools for digestive non-IgE-mediated cow’s milk allergy in toddlers. ClinChem Lab Med, 2013, no. 51, rr. 351-361.
8. Walker W.A. Gastrointestinal host defense: importance of gut closure in control of macromolecular transport. Ciba Found Symp, 1979, rr. 201-219.
9. Berstad A., Arslan G., Folvik G. Relationship between intestinal permeability and calprotectin concentration in gut lavage fluid. Scand J Gastroenterol, 2000, no. 35, rr. 64-69.
10. Rugtveit J., Fagerhol M.K. Age-dependent variations in fecal calprotectin concentrations in children. J Pediatr Gastoenterol Nutr, 2002, no. 34, rr. 323-325.
11. Baldassarre M.E., Altomare M.A., Fanelli M. et al. Does calprotectin represent a regulatory factor in host defense or a drug target in inflammatory disease? Endocr, MetabImmunDisord Drug Targets, 2007, no. 7, rr.1-5.
12. Josefsson S., Bunn S.K., DomelloF.M. Fecal calprotectin invery low birth weight infants. J PediatrGastroenterolNutr, 2007, no. 44, rr. 407-413.