УДК 611.018.6

А.И. ЛЕБЕДЕВА¹, С.А. МУСЛИМОВ¹, В.Ш. ВАГАПОВА², Д.А. ЩЕРБАКОВ¹

¹ Всероссийский центр глазной и пластической хирургии МЗ РФ, г. Уфа

² Башкирский государственный медицинский университет МЗ РФ, г. Уфа

Контактная информация:

Лебедева Анна Ивановна – доктор биологических наук, старший научный сотрудник отдела морфологии

Адрес: 450075, г. Уфа, ул. Р. Зорге, 67/1, тел.: +7 (3472) 93-42-35, e-mail: Jeol02@mail.ru

  Проблема полноценного восстановления скелетной мышечной ткани является актуальной задачей в хирургии, травматологии и других областях медицины. Аллогенные биоматериалы серии «Аллоплант» являются стимулятором регенерации тканей различного происхождения, однако для реконструкции обширных дефектов мышц губчатая модификация биоматериала никогда ранее не использовалась.

Цель исследования – применить аллогенный губчатый биоматериал (АГБ) для восстановления скелетной мышечной ткани. Выявить закономерности замещения трансплантата тканеспецифичным регенератом.

Материал и методы. В опытной серии использовали крыс породы Вистар (n=36). В брюшке икроножной мышцы в средней трети наносили дефект длиной 3–4 мм. В толщу дефекта укладывали аллогенный губчатый биоматериал соответствующих размеров и фиксировали нитевидным сухожильным трансплантатом. Малоберцовый нерв не повреждали. В контрольной группе (n=36) аналогичный дефект ушивали. После чего на кожу накладывали швы Vicryl 6–0. Из опыта животных выводили путем инсуфляции летальной дозы паров фторотана. Забор биопсийного материала проводили через 3, 7, 14, 30, 60 и 90 суток после эксперимента. В работе использовали гистологические и электронномикроскопические методы исследования.

Результаты. В группе животных без применения биоматериала в результате заживления дефекта происходило образование рубца с дальнейшим перерождением в жировую ткань. Применение АГБ при субтотальном дефекте мышцы голени крысы способствовало полному восстановлению дефекта. Выявлено, что АГБ биодеградирует в ткани и становится хемоаттрактантом макрофагов М1. Ингибирует фибробластическую деятельность на уровне миграции клеток и определяет их фенотип. В начальные сроки эксперимента в месте трансплантации происходит синхронно биодеградация АГБ и замещение его рыхлой волокнистой соединительной тканью, сопровождающейся ростом кровеносных сосудов и отростков нервных клеток. Продукты резорбции биоматериала стимулируют миграцию миопрогениторных клеток и способствуют их дифференциации в зрелые мышечные волокна, заполняющие дефект.

Выводы. Аллогенный биоматериал губчатой модификации способствует полноценной регенерации скелетной мышечной ткани голени крысы со всеми структурными элементами: эндомизием, перимизием, ангиогенезом, нейрогенезом.

Ключевые слова: аллогенный губчатый биоматериал, скелетная мышечная ткань, регенерация.

 

 A.I. LEBEDEVA¹, S.A. MUSLIMOV¹, V.Sh. VAGAPOV², D.A. SHCHERBAKOV¹

¹Russian Eye and Plastic Surgery Center, Ufa, the Republic of Bashkortostan, Russian Federation

²Bashkir State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, Ufa, Russian Federation

Morphological aspects of the regeneration of skeletal muscle tissue induced by allogeneic biomaterial

Contact details:

Lebedeva A.I. – D.Sc. (biology), Senior Research Associate of the Department of Morphology.

Address: 67/1 Richard Sorge St., Ufa, the Republic of Bashkortostan, Russian Federation, 450075, tel.: (3472) 93-42-35, e-mail: Jeol02@mail.ru

 The problem of full restoration of skeletal muscle tissue is an important task in surgery, traumatology and other areas of medicine. The allogenic biomaterials of the Alloplant® series stimulate the regeneration of tissues of different origin, however, a spongy modification of the biomaterial has never been used to reconstruct the extensive muscle defects.

Purpose of the study. To apply allogeneic spongy biomaterial (ASB) to restore skeletal muscle tissue. To identify patterns of graft replacement tissue-specific regenerate.

Material and methods. In the experimental series, Wistar rats (n = 36) were used. In the abdomen of the gastrocnemius muscle in the middle third caused a 3–4 mm long defect. An allogeneic spongy biomaterial of appropriate dimensions was placed in the thickness of the defect and fixed with a filamentous tendon graft. Fibial nerve is not damaged. In the control group (n = 36), a similar defect was sutured. After that, Vicryl 6–0 sutures were applied to the skin. The experiment on animals was stopped by insufflation of a lethal dose of fluoroethane vapor. The biopsy material was taken at 3, 7, 14, 30, 60, and 90 days after the experiment. Histological and electron microscopic research methods were applied.

Results. In the group of animals without the use of biomaterial, as a result of healing of the defect, scar formation occurred with further degeneration into adipose tissue. The use of ASB with a subtotal defect in the muscle of the rat tibia contributed to the complete recovery of the defect. It is revealed that ASB is biodegraded in tissue and becomes a chemoattractant of macrophages M1. Inhibits fibroblastic activity at the level of cell migration and determines their phenotype. At the initial time of the experiment at the site of transplantation, the biodegradation of ASB occurs synchronously and its replacement by loose fibrous connective tissue, accompanied by the growth of blood vessels and processes of nerve cells. The products of biomaterial resorption stimulate the migration of myoprogenitor cells and promote their differentiation into mature muscle fibers that fill the defect.

Conclusion. Allogenic biomaterial of spongy modification contributes to the complete regeneration of the skeletal muscle tissue of the rat tibia with all the structural elements: endomysium, perimisium, angiogenesis, and neurogenesis.

Key words: allogenic spongy biomaterial, skeletal muscle tissue, regeneration.

 

Исходом обширных дефектов скелетной мышечной ткани является формирование грубых рубцовых изменений мышечной ткани, замещение дефекта аваскулярной волокнистой соединительной тканью, что может привести к нарушению функционирования мышцы как органа или его атрофии. Причиной неполноценной регенерации служит дефицит и низкая скорость репродукции миопрогениторных клеток на фоне высокой пролиферативной активности фибробластических. Имеющиеся на сегодняшний день методы стимуляции скелетной мышечной ткани в комплексе стандартного хирургического лечения раны часто не удовлетворяют современным требованиям из-за низкой эффективности, развития различного рода осложнений, высокой стоимости, по этическим причинам и т.д.

Одним из перспективных направлений в регенеративной медицине являются тканевая инженерия с использованием биодеградируемых трансплантатов. Биоматериал «Аллоплант» применяется с целью коррекции воспалительно-дегенеративных патологий, который in vivo подвергается резорбции и замещается органотипической тканью окружающего ложа, а продукты деструкции биоматериала проявляют гистоиндуктивные свойства.

Целью исследования явилось изучение влияния аллогенного губчатого биоматериала «Аллоплант» (АГБ) для коррекции посттравматического миогистогенеза.

Материал и методы

В первой опытной группе (36 крыс) в области брюшка мышцы голени в средней трети наносился субтотальный дефект длиной 4–5 мм, занимающий 1/3 мышцы. Место дефекта заполнялось аллогенным биоматериалом губчатой модификации между проксимальной и дистальной культями соответствующих размеров. АГБ фиксировался аллогенной сухожильной нитью. В контрольной серии (n=36) в области икроножной мышцы был нанесен дефект длиной 3–4 мм. После чего в обоих случаях на кожу накладывали швы Vicryl 6–0. Малоберцовый нерв не повреждали. АГБ был изготовлен в данном случае из сухожилий крысы. Использовали гистологические, гистохимические, иммуногистохимические (MyoD, vimentin, FGF-b1, TGF-b1, CD68, TNF-a, IL1) и электронномикроскопические, морфометрические и статистические методы.

Результаты

В контрольной группе после резекции и ушивания мышцы фаза острого воспаления менялась на пролиферативную. Через 7–14 суток дефект замещался грануляционной тканью, которая была представлена плотными пучками коллагеновых волокон, инфильтрированных макрофагами, фибробластическими и иммуногенными клетками. Среди клеток соединительной ткани преобладали такие клетки фибробластического ряда, как мезенхимные, юные фибробласты и зрелые фибробласты – коллагенобласты II типа с активной коллагенсинтетической деятельностью. На 21–30 сутки на фоне разрастания волокнистой соединительной ткани выявлялись признаки трансформации мезенхимных клеток и фибробластов в адипоциты (рис. 1). Спустя 45 суток в результате заживления формировался соединительнотканно-жировой регенерат.

Рисунок 1.

 Формирование соединительнотканно-жирового регенерата в контрольной группе через 45 суток после начала эксперимента. Окраска по Ван Гизону

Fig. 1.

Formation of connective tissue fat regenerate in the control group 45 days after the start of the experiment. Van Gieson’s stain

Подобное течение посттравматического заживления соответствовало ранее описанному механизму, где скорость коллагеногенеза значительно превосходила процесс миогенеза [1]. Фиброзирование дефекта происходило в условиях низкой васкуляризации. Отмечался дефицит CD68⁺ клеток, по-сравнению с опытной группой (рис. 2а). Определялась выраженная экспрессия профиброгенных факторов (vimentin, TGF-ß1, FGF1) (рис. 2б). Выраженная мезенхимная реакция в контрольной группе способствовала стремительному заполнению мышечного дефекта волокнистой соединительной тканью.

После трансплантации АГБ происходил аппозиционный рост обильно васкуляризированной грануляционной ткани от периферии к центру и постепенное замещение биоматериала. АГБ резорбировался макрофагами. Причем CD68⁺ клетки являлись доминирующими клетками в провизорной ткани и их количество значительно превалировало в сравнении с контрольной группой. Фенотип макрофагов определялся как М1, так как они секретировали преимущественно провоспалительные монокины (TNF-a, IL1) (рис. 2 в, г).

Рисунок 2.

Динамика численности макрофагов после применения АГБ и в контроле, секретирующих: а – CD68⁺ монокины, б – TGF-ß1⁺, в – IL-1⁺, г – TNF-a⁺. Ось абсцисс – дни. Ось ординат – среднее число клеток. ГДИ – границы доверительного интервала для средних, ±СО – стандартная ошибка среднего значения

Fig. 2.

Dynamics of the number of macrophages after application of allogenic spongy biomaterial and in the control secreting: a — CD68 + monokines, б — TGF-ß1 +, в — IL-1 +, г — TNF-a +. Axis of abscisses is days. The ordinate axis is the average number of cells. LCI — limits of the confidence interval for averages, ± CO — standard error of the mean

Макрофаги М1 в опытной группе обуславливали полноценный фагоцитоз раневого детрита, предупреждали выраженную экспрессию фиброгенных факторов. Известно, что экспрессия в ткани TNFa конкурентно ингибирует TGF-ß1, задерживает или исключает миграцию М2 макрофагов и секрецию ими ростовых факторов, таких как TGF-ß1 [2]. В регенерате выявлялась низкая численность соединительнотканных клеток, экспрессирующих профиброгенные цитокины (vimentin, FGF-b1, TGF-ß1), по сравнению с контрольной группой.

Через 7–14 суток воспалительная инфильтрация в реактивной зоне менялась на макрофагально-фибробластическую. При этом фибробласты характеризовались как коллагенобласты I типа – клетки с умеренным синтезом коллагена.

Наряду с соединительнотканными клетками выявлялись признаки ранней активации и пролиферация миогенных клеток предшественников (MyoD⁺), по-сравнению с контрольной группой. В дальнейшем миопрогениторные клетки дифференцировались в зрелые миоциты, формировали миотубы и миосимпластические структуры. В процессе замещения АГБ происходило образование мышечно-соединительнотканного регенерата с преобладанием органотипической васкуляризированной рыхлой соединительной ткани, доля которой со временем снижалась и замещалась мышечной (рис. 3). Известно, что макрофаги способствуют успешному приживлению миогенных клеток предшественников в раннем периоде заживления скелетной мускулатуры [3, 4, 5].

Рисунок 3.

Соединительнотканно-мышечный регенерат через 14 суток после имплантации в скелетную мышцу крысы АГБ. Окраска по Нохт—Максимову

Fig. 3.

Connective tissue-muscular regenerate 14 days after implantation of allogenic spongy biomaterial into the skeletal muscle of the rat. Coloring according to Nokht-Maximov

Через 30 суток в очаге трансплантации обнаруживался мышечно-соединительнотканный регенерат с преобладанием мышечной ткани. Параллельно ориентированные пучки мышечных волокон врастали в каналы предсуществующего губчатого трансплантата, гипертрофировались и постепенно вытесняли стромальные элементы на периферию мышечного пучка, который становился эндомизием и перимизием. Через 60–90 суток регенерат был представлен пучками мышечных волокон со всеми структурными элементами, включая нервно-мышечные синапсы (рис. 4).

Рисунок 4.

Новообразованная мышечная ткань в зоне трансплантации АГБ спустя 90 суток. Окраска гематоксилином и эозином

Fig. 4.

Newly formed muscle tissue in the area of transplantation of allogenic spongy biomaterial after 90 days. Stained with hematoxylin and eosin

В данном случае соединительная ткань выступает в качестве «источника индукционно-информативной тканевой регуляции», а мышечная ткань является регулируемой системой [6].

Таким образом, при использовании АГБ наблюдалось восстановление скелетной мышечной ткани на месте утраченной, в то время как в контрольной группе без применения биоматериала происходило формирование неполноценного соединительнотканно-жирового регенерата.

Биоматериалы «Аллоплант» изготавливаются из аллогенных кадаверных волокнистых соединительнотканных образований. В состав биоматериала входит коллаген и связанные с ним протеогликаны и гликозаминогликаны [7]. Известно, что экстрагируемые из биоматериала «Аллоплант» протеогликаны тормозят пролиферацию клеток, обладающих высокой митотической активностью, в том числе фибробластов [8]. Коллаген, вероятно, являясь средством заместительной терапии в поврежденной скелетной ткани, ингибирует фибробластическую активность по типу обратной связи и участвует в торможении пролиферативной и коллагенсинтетической функции фибробластов.

Немаловажное значение играет уникальная технология и модификация биоматериала в данном эксперименте. Баланс скорости биодеградации и неогистогенеза был синхронизирован за счет специальной обработки биоматериала. Его губчатая форма играла формообразующую роль, реконструировала соединительнотканный остов, выполняя функцию мышечного каркаса. АГБ позволяла компенсировать объемный дефект мышечного брюшка, тем самым регулировала силы натяжения культей мышцы, что также препятствовало фиброзированию.

Выводы

Аллогенный губчатый биоматериал, используемый для пластики брюшка икроножной мышцы, в эксперименте полностью замещается органотипичным регенератом, состоящим из скелетной мышечной ткани, эндомизия и перимизия с развитой сетью кровеносных сосудов и отростками нервных клеток. Продукты биодеградации АГБ стимулируют миграцию М1 макрофагов, ангиогенез, хемотаксис миопрогениторных клеток и их дифференциацию в зрелый симпласт. Описанный способ восстановления скелетной мышечной ткани применим в хирургической практике.

Работа выполнена в рамках государственного задания: регистрационный номер НИОКР 115040870057 от 8.04.2015 г.

 Лебедева А.И.– http:/orcid.org/0000-0002-9170-2600

Муслимов С.А. – http:/orcid.org/0000-0002-9076-0251

Вагапова В.Ш. – http:/orcid.org/0000-0002-9349-2328

Щербаков Д.А. – http:/orcid.org/0000-0002-4334-3789

ЛИТЕРАТУРА

1. Данилов Р.К. Раневой процесс: гистогенетические основы. – СПб: ВМедА имени С.М. Кирова, 2008. – 308 с.
2. Abraham D.J., Shiwen X., Black C.M., Sa S., Xu Y., Leask A. Tumor necrosis factor αsuppresses the induction of connective tissue growth factor by transforming growth factor-β in normal and scleroderma fibroblasts // J. Biol Chem. – 2000. – Vol. 275, Is. 20. – P. 15220–15225.
3. Lesault P.F. Macrophages improve survival, proliferation and migration of engrafted myogenic precursor cell into MDX skeletal muscle / P.F. Lesault, M. Theret, M. Magnan et al // PLoS One. – 2012. – Vol. 7, № 10. – P. 46698.
4. Segawa M., Fucada S., Yomamato Y., et al. Suppression of macrophage functions impairs skeletal muscle regeneration with severe fibrosis // Experimental cell research. – 2008. – Vol. 314. – P. 3232–3244.
5. Stefater J.A. Metchnikoff,s policemen: macrophages in development, homeostasis and regeneration / J.A. Stefater, S. Ren, R.A. Lang, J.S. Duffield // Trends Mol Med. – 2011. – Vol. 17, № 12. – P. 743–752.
6. Клишов А.А. Гистогенез и регенерация тканей. Л.: Медицина, 1984. – 232 с.
7. Хасанов Р.А. Инъекционная форма аллотрансплантатов серии «Аллоплант». Получение, анализ и биологическая активность: автореф. дисс. …канд. фарм. наук. – Пермь, 1999. – 24 с.
8. Мулдашев Э.Р., Уимет Т.Дж., Курчатова Н.Н. с соавт. Влияние экстракта трансплантата для пластики века серии Alloplant на синтез ДНК в культуре клеток // Бюл. эксперим. биологии и медицины. – 1994. – № 1. – С. 75–79.

REFERENCES

1. Danilov R.K. Ranevoy protsess: gistogeneticheskie osnovy [Wound process: histogenetic basis]. Saint Petersburg: VMedA imeni S.M. Kirova, 2008. 308 p.
2. Abraham D.J., Shiwen X., Black C.M., Sa S., Xu Y., Leask A. Tumor necrosis factor α suppresses the induction of connective tissue growth factor by transforming growth factor-β in normal and scleroderma fibroblasts. J. Biol Chem, 2000, vol. 275, is. 20, pp. 15220–15225.
3. Lesault P.F., Theret M., Magnan M. et al. Macrophages improve survival, proliferation and migration of engrafted myogenic precursor cell into MDX skeletal muscle. PLoS One, 2012, vol. 7, no. 10, pp. 46698.
4. Segawa M., Fucada S., Yomamato Y. et al. Suppression of macrophage functions impairs skeletal muscle regeneration with severe fibrosis. Experimental cell research, 2008, vol. 314, pp. 3232–3244.
5. Stefater J.A., Ren S., Lang R.A., Duffield J.S. Metchnikoff,s policemen: macrophages in development, homeostasis and regeneration. Trends Mol Med, 2011, vol. 17, no. 12, pp. 743–752.
6. Klishov A.A. Gistogenez i regeneratsiya tkaney [Histogenesis and tissue regeneration]. Leningrad: Meditsina, 1984. 232 p.
7. Khasanov R.A. In»ektsionnaya forma allotransplantatov serii “Alloplant”. Poluchenie, analiz i biologicheskaya aktivnost’: avtoref. dis. …kand. farm. nauk [Injectable form of allografts of the Alloplant series. Production, analysis and biological activity. Synopsis of dis. PhD pharm. sciences]. Perm, 1999. 24 p.
8. Muldashev E.R., Uimet T.Dzh., Kurchatova N.N. et al. Effect of graft extract for plastics of the century of the Alloplant series on DNA synthesis in cell culture. Byul. eksperim. biologii i meditsiny, 1994, no. 1, pp. 75–79 (in Russ.).