УДК 617.7-007.681-089

 М.М. БИКБОВ¹, И.И. ХУСНИТДИНОВ¹, Р.Р. ВИЛЬДАНОВА², С.С. ОСТАХОВ², Р.Р. КАЮМОВА², Н.Н. СИГАЕВА²

¹Уфимский НИИ глазных болезней АН РБ, 450008, г. Уфа, ул. Пушкина, д. 90

²Уфимский институт химии РАН, 450054, г. Уфа, пр. Октября, д. 71

Бикбов Мухаррам Мухтарамович ― доктор медицинских наук, профессор, директор, тел. (347) 272-37-75, e-mail: niipriem@yandex.ru

Хуснитдинов Ильнур Ильдарович ― кандидат медицинских наук, заведующий II микрохирургическим отделением, e-mail: husnitdinov.ilnu@mail.ru

Вильданова Регина Рафаилевна ― кандидат химических наук, младший научный сотрудник лаборатории стереорегулярных полимеров, e-mail: regina777@list.ru

Остахов Сергей Станиславович ― кандидат химических наук, старший научный сотрудник, e-mail: ostahov@anrb.ru

Каюмова Регина Робертовна ― кандидат химических наук, научный сотрудник, e-mail: regina.kayumova.86@mail.ru

Сигаева Наталия Николаевна ― доктор химических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории стереорегулярных полимеров, e-mail: gip@anrb.ru

В статье представлены результаты применения разработанного гидрогеля в качестве носителя луцентиса при антиглаукомных операциях. Экспериментальные исследования проведены на 12 (12 глаз) здоровых кроликах. В условиях in vitro и in vivo экспериментов доказано, что луцентис, введенный в составе 0,1 мл гидрогелевого дренажа в зону антиглаукомной операции, высвобождается постепенно и подавляет пролиферацию соединительной ткани. Подобрана оптимальная концентрация луцентиса ― 0,02 мл в 0,1 мл геля.

Ключевые слова: гидрогели, Луцентис, НГСЭ, первичная открытоугольная и рефрактерная глаукома.

 

M.M. BIKBOV¹, I.I. KHUSNITDINOV¹, R.R. VILDANOVA², S.S. OSTAKHOV², R.R. KAYUMOVA², N.N. SIGAEVA²

¹Ufa Scientific-Research Institute for Eye Diseases of the Academy of Sciences of the Republic of Bashkortostan, 90 Pushkin Str., Ufa, Russian Federation, 450008

²Ufa Institute for Chemistry of the Russian Academy of Sciences, 71 Oktyabrya Pr., Ufa, Russian Federation, 450054

 Hydrogels based on hyaluronic acid and chitosan as a carrier of Lucentis in glaucoma surgery

 Bikbov M.M. ― D. Med. Sc., Professor, Director, tel. (347) 272-37-75, e-mail: niipriem@yandex.ru

Khusnitdinov I.I. ― Cand. Med. Sc., Head of the 2^nd Microsurgical Department, e-mail: husnitdinov.ilnu@mail.ru

Vildanova R.R. ― Cand. Chem. Sc., Junior Researcher of the Laboratory of Stereoregular Polymers, e-mail: regina777@list.ru

Ostakhov S.S. ― Cand. Chem. Sc., Senior Researcher, e-mail: ostahov@anrb.ru

Kayumova R.R. ― Cand. Chem. Sc., Researcher, e-mail: regina.kayumova.86@mail.ru

Sigaeva N.N. ―  D. Chem. Sc., Professor, Leading Researcher of the Laboratory of Stereoregular Polymers, e-mail: gip@anrb.ru

The article presents the results of application of the developed hydrogel as a Lucentis carrier in glaucoma surgeries. Experimental studies were carried out on 12 (12 eyes) healthy rabbits. In vitro and in vivo experiments proved that Lucentis, introduced in 0.1 ml of hydrogel drainage into glaucoma surgery zone, was being released gradually and inhibited the proliferation of connective tissue. The desirable concentration of Lucentis was found to be 0.02 ml in 0.1 ml of gel.

Key words: hydrogels, Lucentis, primary open-angle and refractory glaucoma.

 

В последнее время в связи с увеличением продолжительности жизни человека, растет заболеваемость глаукомой и катарактой [1]. Актуальной проблемой является лечение рефрактерной, т.е. резистентной к традиционному лечению глаукомы. Чаще всего в хирургическом лечении рефрактерной глаукомы (РГ) применяются фистулизирующие операции, антиметаболиты и дренажная хирургия [1-4]. Эффективность классических фистулизирующих операций при РГ в отдаленные сроки невысока ― 30-60% [5]. Известно, что вокруг имплантатов формируется соединительнотканная капсула, которая в свою очередь снижает гипотензивный эффект антиглаукомной операции [6, 7]. Анти-VEGF препараты ― имеют сосудистое и цитостатическое действие. Оказывают не только избирательное действие на эндотелиальные сосудистые клетки, а также на миграцию макрофагов и пролиферацию фибробластов [8]. Отмечается формирование диффузной и менее васкулярной фильтрационной подушки при сочетании антиметаболитов и анти-VEGF препаратов в хирургии глаукомы [9, 10]. Для пролонгированной доставки анти-VEGF препаратов в зону антиглаукомной операции нами был разработан гидрогель на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана [11, 12].

 Цель исследования ― экспериментальное обоснование эффективности биосовместимых биодеградируемых гидрогелей на основе гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана в качестве носителя луцентиса (ранибизумаба) при антиглаукомных операциях.

 Материал и методы

В работе использовались: гиалуроновая кислота (ММ=16х10⁵), полученная с помощью Streptococcus equi, производства «Sigma Aldrich» (Германия), хитозан (ММ = 1,5х10⁵), полученный из краба Дальневосточного, производства «Химмед» (Россия), марки «ч», «Луцентис» (ранибизумаб) производства «Novartis» (Швейцария), фосфатный буфер (рН=7,4). Кинетику высвобождения лекарственного препарата исследовали методом флуоресцентной спектроскопии на спектрофлуориметре «СМ-2203» c использованием кварцевой кюветы толщиной 5 мм при фотовозбуждении под углом 35^оС. Фотовозбуждение проводили при длине волны (l_ex) 270 нм. Записывали спектры флуоресценции (ФЛ) в интервале длин волн эмиссии (l_ex) 300-500 нм. Спектральное разрешение ±2 нм. С помощью предварительно построенной калибровочной кривой находили количество лекарственного препарата, выделившегося к моменту времени t: Q=Q_s/Q₀·100%, здесь Q₀ и Q_s ― количество луцентиса (мл), введенного в гель и выделившегося к моменту времени t. Гидрогелевый дренаж (ГД) получали непосредственно перед операцией. Для этого раствор лекарственного препарата «Луцентис» (0,23 мл) смешивали с раствором диальдегида гиалуроновой кислоты (0,5 мл), затем добавляли раствор сукцината хитозана (0,5 мл). Гидрогелевая лекарственная форма формировалась в течение минуты при комнатной температуре [12, 13]. Содержание лекарственного препарата в гидрогеле составляло 0,187-0,200 мл на 1 мл геля (патент РФ на изобретение №2610368 от 26.10.15).

Эксперимент In Vitro. Для определения степени диффузии лекарственного препарата из ГД в физиологический раствор во времени использовали модельный опыт, в котором ГД в диализном мешочке помещали в бюкс при температуре 37±0,1°С. Через определенные промежутки времени фиксировали кинетику изменения ФЛ.

Эксперимент In Vivo. Экспериментальные исследования проведены на 12 (12 глаз) здоровых кроликах породы «Шиншилла» примерно одного возраста и веса (2500-3000 г). В эксперименте на модели непроникающей глубокой склерэктомии (НГСЭ) с микроперфорацией тестировался ГД с луцентисом. Животные были разделены на две опытные группы. Первую группу составили 6 глаз ― 0,187 мл на 1 мл геля. Разовая доза ГД составила 0,1 мл. В контрольной группе интраоперационно применялся ГД без добавления луцентиса (6 глаз). Дополнительную контрольную группу НГСЭ без ГД не выполняли, так как результаты подобной операции в условиях эксперимента детально описаны в литературе [14]. Для изучения динамики морфологических изменений, животных выводили из опыта на 7, 14 и 28 сутки после операции передозировкой кетамин и ксилазин.

 Результаты

Поскольку возможность практического применения полученного лекарственного гидрогеля определяют реологические свойства, проведено их исследование (табл. 1). Тот факт, что модуль накопления геля намного больше модуля потерь, свидетельствует о преобладании упругих свойств над вязкими свойствами геля, что подтверждает химически сшитую структуру сетки гидрогеля [15].

Таблица.

Реологические характеристики гидрогеля на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана

Модуль накопления G’, Па	Модуль потерь, Па	Динамическая вязкость, Па·с	Частота сшивок νe х1021, м3	Расстояние между узлами сшивок ξ х108, м
800	170	1270	200	1,7

Такой материал физически, химически и механически имитирует свойства соединительных тканей, за счет упругих свойств способен поддерживать стенки хирургически сформированного канала и обеспечивать диффузию лекарственного препарата.

При разработке лекарственной дренажной формы важным показателем является скорость высвобождения лекарственного препарата. Как следует из представленных данных на рисунке 1, наиболее интенсивное высвобождение луцентиса из геля регистрируется в первые 1,5 часа. Кинетические кривые диффузии луцентиса в течение 6 часов практически выходят на предел, соответствующий равновесному медленному выделению препарата. Оставшееся количество луцентиса в дальнейшем выделяется постепенно по мере смещения равновесия в системе и тем самым пролонгирует эффект подавления пролиферации фибробластов.

Рисунок 1.

Кинетическая кривая диффузии луцентиса в физиологический раствор из гидрогеля на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана. Температура 37⁰С

Гистологические исследования

Анализ гистологических исследований экспериментальных животных I группы спустя 7 суток установил на срезах в толще склеры интрасклеральную полость (ИСП) с рыхлыми и неровными стенками. Вокруг ― неравномерно расположенные коллагеновые волокна, межуточный отек (рис. 2А). Спустя 3 недели при морфологических исследованиях зоны операции ИСП сохраняется. В области ресничного тела интрасклерально визуализируются небольшие полости с тонкими стенками. Окружающая волокнистая ткань с признаками умеренного разрыхления, слабо выраженного коллагеногенеза (рис. 2Б). Через 6 недель эксперимента в толще склеры определяются единичные полости, ограниченные волокнистой тканью. В окружающих области операции структурах выявляется умеренный отек с разволокнением коллагеновых структур. Однако, просматривается ИСП, что свидетельствует о сохранности оттока ВГЖ (рис. 2В).

В результате гистологического исследования контрольной группы на 7 сутки после операции интрасклерально обнаружены полости с неровными стенками, ограниченные плотной волокнистой тканью. В окружающей полости ткани склеры определяется выраженный коллагеногенез. Единичные сосуды с признаками кровенаполнения (рис. 2Г). Через 3 недели в толще склеры определяются поля усиленного коллагеногенеза, единичные небольшие полости в области оперативного вмешательства. По сравнению с 1 группой исследования отмечается отсутствие сформированной ИСП, что свидетельствовало о ее рубцевании (рис. 2 Д). На 6 неделе при исследовании среза склеры в области ресничного тела установлено очаговое утолщение за счет полей разрастания соединительной ткани и отложения коллагена (рис. 2 Е). При исследовании гистологических снимков глаз контрольной группы мы не обнаружили объективных признаков токсического влияния ГД на окружающие ткани.

Рисунок 2.

Гистологические исследования зоны операции после моделирования НГСЭ в глазах кроликов. Окраска гематоксилин и эозин, ув. х100 и х200

Вывод

Доказана безопасность и эффективность применения гидрогелевого дренажа с луцентисом (ранибизумабом) на основе диальдегида гиалуроновой кислоты и сукцината хитозана при антиглаукомных операциях. В условиях in vitro и in vivo экспериментов доказано, что луцентис, введенный в составе 0,1 мл гидрогелевого дренажа в зону антиглаукомной операции, высвобождается постепенно и подавляет пролиферацию соединительной ткани. Подобрана оптимальная концентрация луцентиса ― 0,02 мл в 0,1 мл геля.

 ЛИТЕРАТУРА

1. Guedes G., Tsai J.C., Loewen N.A. Glaucoma and aging // Curr Aging Sci. ― 2011. ― Vol. 4, №2. ― Р. 110-117.
2. Глаукома. Национальное руководство / Под ред. Е.А. Егорова. ― М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. ― 824 c.
3. Бикбов М.М., Хуснитдинов И.И. Каналопластика при глаукоме: хирургическая техника и результаты // Клиническая офтальмология. ― 2014. ― Т. 15, №2. ― С. 78-81.
4. Бикбов М.М., Хуснитдинов И.И. Анализ гипотензивного эффекта имплантации клапана Ahmed при рефрактерной глаукоме // Национальный журнал глаукома. ― 2016. ― Т. 15, №3. ― С. 24-33.
5. Cheng A.C., Yuen K.S., Lai J.S. The Ahmed glaucoma valve in refractory glaucoma: experiences in Indian eyes // Eye. ― 2006. ― Vol. 20, №7. ― Р. 848-849.
6. Бикбов М.М., Хуснитдинов И.И. Послеоперационные осложнения имплантации клапана Ahmed // Клиническая офтальмология. ― 2016. ― №2. ― С. 103-107.
7. Bikbov M.M., Khusnitdinov I.I. The results of the use of Ahmed valve in refractory glaucoma surgery // Journal of Current Glaucoma Practice. ― 2015. ― Vol. 9, №3. ― P. 86-91.
8. Landers J. Avastin in glaucoma surgery… // Clinical and Experimental Ophthal. ― 2012. ― Vol. 40, №8. ― Р. 769-770.
9. Kahook M.Y. Bleb morphology and vascularity after trabeculectomy with intravitreal ranibizumab: a pilot study // Am. J. Ophthalmol. ― 2010. ― Vol. 150, №3. ― Р. 399-403.
10. Chua B.E., Nguyen D.Q., Qin Q., et al. Bleb vascularity following post-trabeculectomy subconjunctival bevacizumab: a pilot study // Clinical and Experimental Ophthal. ― 2012. ― Vol. 40, №8. ― Р. 773-779.
11. Хабаров В.Н. Гиалуроновая кислота: получение, свойства, применение в биологии и медицине. ― М.: Практическая медицина, 2012. ― 224 с.
12. Вильданова Р.Р., Сигаева Н.Н., Куковинец О.С., и др. Модифицированная гиалуроновая кислота в качестве носителя митомицина С для офтальмологии // Химия природных соединений. ― 2014. ― №2. ― Р. 205-207.
13. Вильданова Р.Р., Сигаева Н.Н., Куковинец О.С., и др. Модификация гиалуроновой кислоты и хитозана с целью создания гидрогелей для офтальмологии // Журнал прикладной химии. ― 2014. ― Т. 87, №10. ― С. 1500-1511.
14. Тахчиди Х.П., Тахчиди Е.Х., Новиков С.В., и др. Интраоперационная профилактика рубцевания при моделировании непроникающей глубокой склерэктомии в эксперименте in vivo // Офтальмохирургия. ― 2012. ― №4. ― С. 56-60.
15. Роговина Л.З., Васильев В.Г., Браудо Е.Е. К определению понятия «полимерный гель» // Высокомолекулярные соединения. Серия А. ― 2008. ― Т. 50, №7. ― С. 1397-1406.

REFERENCES

1. Guedes G., Tsai J.C., Loewen N.A. Glaucoma and aging. Curr Aging Sci, 2011, vol. 4, no. 2, pp. 110–117.
2. Egorov E.A. Glaucoma. National guidance, 2013, 824 p. (In Russ.).
3. Bikbov M.M., Khusnitdinov I.I. Canaloplasty in glaucoma: surgical technique and results. RMJ Clinical Ophthalmology, 2014, vol. 15, no. 2, pp. 78-81. (In Russ.)
4. Bikbov M.M., Khusnitdinov I.I. Analysis of hypotensive effect after Ahmed valve implantation in patients with refractory glaucoma Natsionalnyi zhurnal glaucoma, 2016, vol. 15, no. 3, pp. 24-33. (In Russ.).
5. Cheng A.C., Yuen K.S., Lai J.S. The Ahmed glaucoma valve in refractory glaucoma: experiences in Indian eyes. Eye, 2006, vol. 20, no. 7, pp. 848-849.
6. Bikbov M.M., Khusnitdinov I.I. Postoperative complications after Ahmed valve implantation. RMJ Clinical Ophthalmology, 2016, no. 2, pp. 103-107. (In Russ.)
7. Bikbov M.M., Khusnitdinov I.I. The results of the use of Ahmed valve in refractory glaucoma surgery. Journal of Current Glaucoma Practice, 2015, vol. 9, no. 3, pp. 86-91.
8. Landers J. Avastin in glaucoma surgery… Clinical and Experimental Ophthal, 2012, vol. 40, no. 8. pp. 769-770.
9. Kahook M.Yu. Bleb morphology and vascularity after trabeculectomy with intravitreal ranibizumab: a pilot study. Am J Ophthalmol, 2010, vol. 150, no. 3, pp. 399-403.
10. Chua B.E., Nguyen D.Q., Qin Q., Ruddle J.B., Wells A.P., Niyadurupola N., Gupta V., Wong T.T., Coote M.A., Crowston J.G. Bleb vascularity following post-trabeculectomy subconjunctival bevacizumab: a pilot study. Clinical and Experimental Ophthal, 2012, vol. 40, no. 8, pp. 773-779.
11. Chabarov V.N. Hyaluronic acid: production, properties, application in biology and medicine, Practicheskaya medicine, 2012. 224 p.
12. Vildanova R.R., Sigaeva N.N., Kukovinetz O.S., Zaidullin I.S., Fazylova G.R., Kuznetsov S.I., Kolesov S.V. Modified hyaluronic acid as mitomycin C carrier for ophtalmology. Chemistry of natural compounds, 2014, no. 2, pp. 205-207. (In Russ.)
13. Vildanova R.R., Sigaeva N.N., Kukovinetz O.S., Volodina V.P., Spirihin L.V., Zaidullin I.S., Kolesov S.V. Modification of hyaluronic acid and chitosan with the purpose hydrogel designing for ophtalmology. The journal of practical chemistry, 2014, vol. 87, no. 10, pp. 1500–1511. (In Russ.)
14. Takhchidi K.P., Takhchidi E.K., Novikov S.V., Shatskikh A.V., Gorbunova K.S. Intraoperative prevention of scarring on the model of non-penetrating deep sclerectomy in vivo. Ophthalmosurgery, 2012, no. 4, pp. 56-60. (In Russ.)
15. Rogovina L.Z., Vasilyev V.G., Braudo E.E. To the definition of «polymer gel». High-molecular compounds, 2008, vol. 50, no. 7, pp. 1397-1406. (In Russ.)