УДК 616.98

 О.К. ПОЗДЕЕВ¹, Н.Ю. КУРЯЕВА², А.З. ВАЛИУЛЛИНА², В.А. КАРАГАНОВ², М.П. ШУЛАЕВА¹

¹ Казанская государственная медицинская академия — филиал ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России, 420012, Казань, ул. Бутлерова, д. 36

² Республиканская клиническая инфекционная больница имени профессора А.Ф. Агафонова, лабораторный диагностический центр, 420061, Казань, ул. Ершова, д. 54

Контактная информация:

Поздеев Оскар Кимович — профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой микробиологии, тел. (843)233-34-78, e-mail: pozdeevoskar@rambler.ru.

Куряева Назия Юнусовна — заместитель главного врача по лабораторной диагностике, тел. +7-917-257-18-10.

Валиуллина Альфия Зямилевна — врач-бактериолог, тел. +7-917-935-19-03, e-mail: alfaromeo603@gmail.com.

Караганов Владимир Александрович — врач-бактериолог, тел. +7-904-679-80-45, e-mail: karovvl@yandex.ru.

Шулаева Марина Петровна — кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, тел. (843)233-34-78, e-mail: shulaeva.m@mail.ru

Статья поступила: 7.02.2018, принята к печати: 28.03.2018.

В данной статье рассмотрены аспекты продукции β-лактамаз класса AmpC некоторыми представителями семейства Enterobacteriaceae. Предлагается простая и эффективная методика определения β-лактамаз класса AmpC, применимая в рутинной практике бактериологических лабораторий, что имеет большое значение для адекватного выбора антимикробных препаратов при назначении терапии лечащим врачом.

Ключевые слова: нозокомиальные инфекции, β–лактамазы, энтеробактерии, антимикробные препараты.

(Для цитирования: Поздеев О.К., Куряева Н.Ю., Валиуллина А.З., Караганов В.А., Шулаева М.П. Детекция бета-лактамазampc у клинических изолятов энтеробактерий. Практическая медицина. 2018)

O.K. POZDEEV¹, N.Yu. KURYAEVA², A.Z. VALIULLINA², V.A. KARAGANOV², M.P. SHULAEVA¹

¹Kazan State Medical Academy — Branch Campus of the RMACPE MOH Russia, 36 Butlerov Str., Kazan, Russian Federation, 420012

² Republic Clinical Infectious Hospital named after Prof. A.F. Agafonov, 54 Ershov Str., Kazan, Russian Federation, 420061

 Detection of ampC b-lactamases in clinical isolates of enterobacteria

 Pozdeev O.K. — D. Med. Sc., Professor of the Department of Microbiology, tel. (843)233-34-78, e-mail: pozdeevoskar@rambler.ru

Kuryaeva N.Yu. — Deputy Chief Doctor for Laboratory Diagnostics, tel. +7-917-257-18-10

Valiullina A.Z. — bacteriologist, tel. +7-917-935-19-03, e-mail: alfaromeo603@gmail.ru

Karaganov V.A. — bacteriologist, tel. +7-904-679-80-45, e-mail: karovvl@yandex.ru

Shulaeva M.P. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Microbiology, tel. (843) 233-34-78, e-mail: shulaeva.m@mail.ru

The article views certain aspects of AmpC class β-lactamases synthesis by some species of Enterobacteriaceae family. The authors propose a simple and efficient method of AmpC β-lactamases detection, applicable in the routine practice of bacteriological laboratories. The means of detecting the ability to produce such enzymes are important for the adequate choice of antibacterial medications by an attending physician.

Key words: nosocomial infections, b-lactamases, enterobacteria, antimicrobic medications.

На протяжении последних пятидесяти лет в клинической практике отмечают неуклонный рост числа нозокомиальных инфекций, вызванных представителями семейства Enterobacteriaceae и одновременно перманентно возрастающую устойчивость этих бактерий к антимикробным препаратам (АМП) различных классов. Сложившаяся ситуация во многом обусловлена неадекватностью, проводимой эмпирической антибактериальной терапии и ограниченным арсеналом АМП с подтвержденной эффективностью. И на сегодняшний день одной из самых серьезных проблем для современной практической медицины представляют энтеробактерии, проявляющие множественную устойчивость к различным АМП. Распространение подобных штаммов приводит к увеличению сроков госпитализации, росту летальности, а также существенно увеличивает экономические затраты. Особую тревогу вызывает распространение полирезистентности бактерий к β-лактамным антибиотикам (включая карбапенемы), так как набор антибактериальных препаратов, эффективно подавляющих их рост, сегодня ограничен [1, 2].

В значительной степени устойчивость представителей семейства Enterobacteriaceae обусловлена способностью к образованию бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), являющихся своеобразным маркером полирезистентности. При этом изоляты, способные к их продукции, также нередко имеют генетически детерминированную резистентность к АМП других классов (аминогликозидам, фторхинолонам, ко-тримоксазолу). Кроме того, в последние годы установлено носительство (до 40 %)штаммов-продуцентов БЛРС у лиц, не имевших в анамнезе контакта со стационарами, что указывает на их циркуляцию во внебольничных условиях [3–5].

В этом плане особый интерес представляют бета-лактамазы АmpС (цефалоспориназы) грамотрицательных бактерий, не ингибирующиеся клавулановой кислотой. К настоящему времени уже описано более 20 подобных ферментов. У некоторых энтеробактерий цефалоспориназы, кодируемые хромосомными генами, могут экспрессироваться, хотя и на низком уровне, постоянно (например, у E.coli). У других микроорганизмов группы (например, у представителей Enterobacter, Serratia, Morganella и др.) их синтез носит индуцибельный характер, но при нарушении регуляторных механизмов образование АmpС приобретает характер постоянной гиперпродукции. Установлено, что, после появления цефалоспоринов III поколения частота обнаружения подобных штаммов-гиперпродуцентов AmpC в некоторых странах Европы достигает 70 %, а позднее феномен гиперсинтеза АmpС был выявлен у изолятов кишечной палочки и клебсиелл. Следует отметить, что особую угрозу представляет широкое распространение бета-лактамаз АmpС, кодируемых плазмидными генами, как фактора приобретенной резистентности, в том числе у изначально чувствительных энтеробактерий. При этом плазмидные цефалоспориназы AmpC энтеробактерий обусловливают широкий спектр резистентности, включая цефалоспорины III поколения и комбинации бета-лактамных антибиотиков с ингибиторами, являющихся до сих пор самыми «популярными» антибиотиками [6, 7].

В настоящей работе проведено исследование способности представителей семейства Enterobacteriaceae, выделенных из различного клинического материала, к гиперпродукции бета-лактамазAmpC.

Цель исследования: провести изучение эффективности метода выявления гиперпродукции бета-лактамаз AmpC энтеробактериями по величине зон подавления роста бактерий с помощью дисков с цефокситином и цефепимом.

Материалы и методы.

Исследования проведены в бактериологической лаборатории ГАУЗ ГДЦ по ЛДИЗ г. Казани и на базе кафедры микробиологии КГМА в период с 01.07.2014 по15.12.2014 и с 16.12.2014 по 15.12. 2015.

Культуры энтеробактерий были выделены при проведении рутинных бактериологических исследований клинического материала, которым служило: раневое отделяемое, мазки из ушей и глаз, отделяемое половых органов, мокрота, моча, желчь, ликвор, кровь, грудное молоко, секционный материал, а также отпечатки плаценты, отобранные у новорожденных, входящих в группу риска по внутриутробным инфекциям (ВУИ), с клиническими проявлениями гнойно-воспалительных заболеваний. Материал для исследований был получен из стационаров и поликлиник г. Казани.

Принадлежность выделенных микроорганизмов к семейству Enterobacteriaceae определяли общепринятыми методами в соответствии с положениями:

• Приказа МЗ СССР№535 от 22.04.1985г,
• Стандартизованной технологией «Бактериологический анализ мочи» Смоленск, 2012 г.
• «Основные методы лабораторных исследований в клинической бактериологии» ВОЗ, Женева 1994 г.
• Методическими рекомендациями для      врачей-бактериологов «Бактериологическая диагностика внутриутробных инфекций», Казань, 2003 г.
• Приказом № 1203/156 МЗ РТ и ФГУ «Центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора в РТ». «Об усилении профилактики внутрибольничной инфекции в акушерских стационарах, в отделениях реанимации и патологии новорожденных».
• «Практические аспекты современной клинической бактериологии» Москва, 1997г. ТОО «Лабинформ».
• Методическими указаниями 4.2.3115 — 13 «Лабораторная диагностика внебольничной пневмонии».

Идентификацию культур проводили на тест-системах MIKROLATEST и ENTEROtest 16 (ErbaLachemas, Чехия). Также применяли дополнительные биохимические тесты: посевы на жидкую среду с глюкозой (на кислото- и газообразование), на полужидкий агар (для определения подвижности), на среду Кларка (для реакции с метиловым красным и реакции Фогеса-Проскауэра), на среду с аргинином (для определения способности к синтезу аргининдегидролазы), на жидкую среду с арабинозой.

Автоматическое считывание идентификационных тест-систем проводили планшетным фотометром «Multiscan — Ascent»96/384 (MTXLABSystemsInc, США), результаты дополнительных тестов в базу данных компьютера вводили вручную.

Контроль качества ENTEROtest 16 проводили согласно прилагаемой инструкции с помощью контрольных,референтных бактериальных культур SerratiamarcescensCCM 303, Proteusvulgaris ССМ 1799 и Edvardsiellatarda ССМ 2238.

Изучение чувствительности к антибиотикам проводили диско-диффузионным методом на агаре Мюллер-Хинтона в соответствии с рекомендациями МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Способность к гиперпродукции бета — лактамаз AmpC определяли с помощью дисков сцефокситином (30мкг) и цефепимом (30мкг) производства Bio-RadLaboratories, Inc (США).

Для этого к препаратам первого ряда: ампициллин (10мкг), амоксициллин-клавуланат (20/10 мкг), гентамицин (10 мкг)ципрофлоксацин (5 мкг)цефотаксим (30мкг) цефтазидим (30мкг) добавляли диски с цефокситином (30мкг) и цефепимом (30 мкг). Если изолят оказывался чувствительным к цефокситинуи резистентным к цефепиму при устойчивости к цефтазидиму и цефотаксиму, то его расценивали как возможный продуцент БЛРС. Если он проявлял устойчивость к цефокситину, но был чувствительным к цефепиму, а также был устойчив к цефотаксиму и цефтазидиму, то его определяли, как штамм — гиперпродуцентплазмидной AmpC. EUCAST рекомендует снизить дозу цефтазидима до 10 мкг, цефотаксима до 5 мкг, для более высокой чувствительности при детекции БЛРС.

Исследования в соответствии с рекомендациями EUCAST 2015 (Европейского Комитета по определению чувствительности микроорганизмов к антибиотикам) не проводили, так как в период проведения исследований они еще не были внедрены в практику лаборатории.

Внутрилабораторный контроль дисков с антибактериальными препаратамицефепимом и цефокситином проводили с использованием контрольного штамма E. coli АТСС 25922.

Результаты и обсуждение

Основным клиническим материалом, поступившим на исследование из поликлиник г. Казани, являлась моча. Из всего объема образцов, поступивших с июня 2014 г. по декабрь 2015 г., было выделено 162 изолята кишечной палочки. Среди них было протестировано 11 штаммов. Исследовали изоляты, которые были устойчивыми к цефотаксиму, цефтазидиму (вероятные продуценты БЛРС) и только те из них, которые проявили чувствительность к цефепиму и устойчивость к цефокситину, всего 3 культуры (27,3 %) оказались способны к гиперпродукции AmpC.

Значительно большее количество бактерий-продуцентов АmрС (17 изолятов) было выделено из различных образцов клинического материала, полученных из стационаров г. Казани (табл. 1).

Несмотря на то, что количество образцов, полученных из стационаров, было больше таковых, доставленных из поликлиник, можно заключить, что в целом штаммы — гиперпродуценты AmpC в клинических образцах из стационаров встречались чаще. Ввиду малого количества протестированных культур Morganellamorganii (2) обнаруженные культуры — продуценты AmpC были оформлены в виде списков для предоставления заинтересованных ЛПУ и не подлежат статистическому анализу.

Таблица 1.

Результаты изучения способности представителей семейства Enterobacteriaceae, выделенных из всего клинического материала (в том числе из мочи, мокроты, раневого отделяемого) к гиперпродукцииAmpC 

Полученные результаты подтверждают результаты многочисленных исследований о преобладании изолятов энтеробактерий, способных к гиперпродукции плазмидных AmpC, среди культур, выделенных от больных, получающих длительную или интенсивную антибиотикотерапию. Зависимость частоты выделения культур- продуцентов АmрС от диагноза и вида биоматериала представлена в табл. 2.

Таблица 2.

Частота выделения бактерий-продуцентов АmрСиз различных биоматериалов, отобранных у пациентов, находящихся на стационарном лечении 

Интерес представляет и тот факт, что среди 284 протестированных изолятов кишечной палочки лишь 4 были способны к гиперпродукции AmpC, кодируемых плазмидными генами. Этот факт можно объяснить тем, что у этих бактерий достаточно распространены хромосомные гены, кодирующие синтез подобных БЛРС и их наличие, препятствует горизонтальному переносу плазмидных генов [8].

В ходе проведенного исследования установлено, что наибольшее количество штаммов-продуцентов АmpС было обнаружено в образцах клинического материала, полученного от новорожденных, находящихся на лечении в отделениях интенсивной терапии и реанимации детских стационаров, что указывает на внутрибольничную циркуляцию подобных бактерий (табл. 3).

Таблица 3.

Частота обнаружения штаммов — гиперпродуцентов плазмидных β-лактамаз AmpC среди представителей семейства Enterobacteriaceae в различных образцах клинического материала, полученного из стационаров.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:

1. В наших исследованиях наибольшее число штаммов-продуцентов AmpC было выявлено среди представителей рода Enterobacterspp. Наименьшее количество выявлено среди выделенных штаммов кишечной палочки.
2. Для лечения заболеваний, вызванных продуцентами АmрС, рекомендуется применение цефепима (цефалоспорин 4 поколения). В качестве препаратов монотерапии следует исключить цефалоспорины 3-го поколения (цефтазидим, цефотаксим, цефтриаксон и т.п.).
3. При использовании цефалоспоринов третьего поколения высока вероятность появления резистентных СДР (стабильно дерепрессированных) штаммов (особенно E. cloacae), а они в свою очередь пока еще сохраняют чувствительность к цефалоспоринам четвертого поколения, поэтому цефепим является наиболее предпочтительной альтернативой в лечении.
4. Терапия с использованием ингибитор-защищенных β-лактамных антибиотиков может быть так же неэффективной, поскольку ингибиторы не подавляют AmpC, тогда как клавуланат может индуцировать синтез AmpC.
5. Фенотипический метод выявления гиперпродукции бета-лактамаз AmpC среди представителей семейства Enterobacteriaceae очень прост и доступен в рутинной практике обычных бактериологических лабораторий, такие штаммы могут быть выявлены в лаборатории на основании следующего фенотипа: цефалоспорины третьего поколения –R (резистентны), Цефокситин — R (у Enterobactercloaceaприродная резистентность), Цефепим–S (чувствительный).

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, финансовой поддержки, о которых необходимо сообщить.

Литература

1. World Health Organization. Antimicrobialresistance: Globalreportonsurveillance. World Health Organization; Geneva, Switzerland: 2014.
2. Chang H.-H., Cohen T., Grad Y., Hanage W.P., O’Brien T., Lipsitch M. // Origin and Proliferation of Multiple-Drug Resistance in Bacterial Pathogens. // MicrobiolMolBiol Rev. 2015; 79 (1): 101–116.
3. Exner M., Bhattacharya S., Christiansen B., e.a. // Antibiotic resistance: What is so special about multidrug-resistant Gram-negative bacteria? // GMS Hyg Infect Control. 2017; 12: Doc05.
4. 4.Bell B., Schellevis F., Stobberingh E., Goossens H., Pringle M. // A systematic review and meta-analysis of the effects of antibiotic consumption on antibioticresistance. // BMC Infect Dis. 2014; 13:14.
5. Jacoby G. AmpC beta-lactamases. // Clin Microbiol Rev.// 2009;22 (1):161–82.
6. Blair J.M.A., Webber M.A., Baylay A.J., Ogbolu D.O., Piddock L.J.V. // Molecular mechanisms of antibiotic resistance. // Nat. Rev. Microbiol. 2015;13:42–51
7. Rodrнguez-Martнnez J. Fernбndez-Echauri P. Fernбndez-Cuenca F., et al. // Characterization of an extended-spectrum AmpC cephalosporinase with hydrolysing activity against fourth-generation cephalosporins in a clinical isolate of Enterobacter aerogenes selected in vivo. // J Antimicrob Chemother.2012; 67 (1):64–68.
8. Navarro F., Mirу E., Mirelis B. // Interpretive reading of enterobacteria antibiograms. // Enferm Infecc Microbiol Clin.// 2010;28 (9):638–45.

REFERENCES

1. World Health Organization. Antimicrobialresistance: Globalreportonsurveillance. World Health Organization. Geneva, Switzerland: 2014.
2. Chang H.-H., Cohen T., Grad Y., Hanage W.P., O’Brien T., Lipsitch M. Origin and Proliferation of Multiple-Drug Resistance in Bacterial Pathogens. MicrobiolMolBiol Rev.,2015; 79 (1): 101–116.
3. Exner M., Bhattacharya S., Christiansen B. et all. Antibiotic resistance: What is so special about multidrug-resistant Gram-negative bacteria? GMS Hyg Infect Control., 2017; 12: Doc05.
4. .Bell B., Schellevis F., Stobberingh E., Goossens H., Pringle M. A systematic review and meta-analysis of the effects of antibiotic consumption on antibioticresistance. BMC Infect Dis., 2014; 13:14.
5. Jacoby G. Amp C beta-lactamases. Clin Microbiol Rev., 2009;22 (1):161–82.
6. Blair J.M.A., Webber M.A., Baylay A.J., Ogbolu D.O., Piddock L.J.V. Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nat. Rev. Microbiol.,2015;13:42–51
7. Rodrнguez-Martнnez J. Fernбndez-Echauri P. Fernбndez-Cuenca F. et al. Characterization of an extended-spectrum AmpC cephalosporinase with hydrolysing activity against fourth-generation cephalosporins in a clinical isolate of Enterobacter aerogenes selected in vivo. J Antimicrob Chemother.,2012; 67 (1):64–68.
8. Navarro F., Mirу E., Mirelis B. Interpretive reading of enterobacteria antibiograms. Enferm Infecc Microbiol Clin., 2010;28 (9):638–45.